Alterations of δ-opioid receptor mobility and function by acute and chronic depletion of plasma membrane cholesterol content of live cells
Project goals
Detailed analysis of the effect of acute and chronic depletion of cell cholesterol level on δ-opioid receptor mobility and function in plasma membrane of model cell lines. For this aim, HEK293 and NG108-15 cells transiently expressing δ-OR-eCFP and δ-OR-eYFP will be analyzed by advanced techniques of fluorescence microscopy FRAP, RICS, FCS, TIRF and 2PPM. Subsequently, alterations of δ-OR mobility will be correlated with alterations of agonist ligand binding, and function of δ-OR measured by agonist-stimulated [35S]GTPγS binding. These experiments will be performed in HEK293 cells stably expressing FLAG-δ-OR and NG108-15 cells. “Antibody feeding” method will be used to distinguish internalized and cell surface pools of δ-OR. Functional studies of δ-OR will be performed in isolated plasma membranes and detergent-untreated, low-density membrane domains. Project will extend the insight into the toxic side-effects of statin-based therapies and bring new knowledge about correlation between lateral mobility of δ-OR in plasma membrane of live cells and its functional significance.
Keywords
δ-opioid receptorlateral mobilityplasma membranecholesterol depletionstatinsconfocal fluorescence microscopyagonistsG-protein stimulation
Public support
Provider
Czech Science Foundation
Programme
Standard projects
Call for proposals
Standardní projekty 21 (SGA0201700001)
Main participants
Fyziologický ústav AV ČR, v. v. i.
Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v. v. i.Contest type
VS - Public tender
Contract ID
17-05903S
Alternative language
Project name in Czech
Změny mobility a funkce receptoru pro opioidy typu δ vyvolané akutní a chronickou deplecí cholesterolu v plazmatických membránách živých buněk
Annotation in Czech
Podrobný rozbor vlivu akutní a chronické deplece obsahu buněčného cholesterolu na mobilitu a funkci δ-opioidního receptoru v plazmatické membráně modelových buněčných linií. Pro tento účel budou buňky linií HEK293 a NG108-15 transientně exprimující δ-OR-eCFP a δ-OR-eYFP analyzovány pomocí pokročilých metod fluorescenční mikroskopie FRAP, RICS, FCS, TIRF a 2PPM. Následně budou změny mobility δ-OR korelovány se změnami vazby specifických agonistů a funkce δ-OR měřené schopností agonistů stimulovat vazbu [35S]GTPγS. Experimenty budou provedeny v linii HEK293 stabilně exprimující FLAG-δ-OR a NG108-15 buňkách. K rozlišení membránově vázaných a internalizovaných δ-OR bude použita metoda značení extracelulárního epitopu (FLAG) protilátkami. Funkce δ-OR bude studována v plazmatických membránách a membránových doménách s nízkou hustotou, které budou izolovány bez použití detergentu. Projekt rozšíří znalosti škodlivých vedlejších účinků statinové terapie a poskytne nové poznatky o vztahu mezi laterálním pohybem δ-OR v plazmatické membráně živých buněk a jeho funkčním významem.
Scientific branches
Completed project evaluation
Provider evaluation
U - Uspěl podle zadání (s publikovanými či patentovanými výsledky atd.)
Project results evaluation
Role of cholesterol depletion and calcium ions on lateral mobility of delta-opioid receptors was assessed using a newly developed method of FRAP analysis with broad use in membrane biology, and other techniques. The results of the project and studies on project-related topics were published in 8 articles in journals with IF. Project administration and financial discipline were excellent.
Solution timeline
Realization period - beginning
Jan 1, 2017
Realization period - end
Dec 31, 2019
Project status
U - Finished project
Latest support payment
Apr 26, 2019
Data delivery to CEP
Confidentiality
S - Úplné a pravdivé údaje o projektu nepodléhají ochraně podle zvláštních právních předpisů
Data delivery code
CEP20-GA0-GA-U/02:1
Data delivery date
Jul 23, 2020
Finance
Total approved costs
6,619 thou. CZK
Public financial support
6,199 thou. CZK
Other public sources
420 thou. CZK
Non public and foreign sources
0 thou. CZK
Basic information
Recognised costs
6 619 CZK thou.
Public support
6 199 CZK thou.
93%
Provider
Czech Science Foundation
CEP
CE - Biochemistry
Solution period
01. 01. 2017 - 31. 12. 2019