Structure and dynamics of high and low affinity ATP binding sites of Na+/K+-ATPase
Project goals
Na+/K+-ATPase has two ATP sites which cooperate during catalysis in a negative coopartive way with ATP as substrate and in a positive cooperative way with MANT-ATP. The high affinity ATP site (E1ATP site) can be modified by fluorescein isothiocyanate (FITC) at lysine 501 in a covalent way. This lets the partial activity of the E2ATP site (K+-activated p-nitrophenylphosphatase unaffected. We recently became aware that the E2ATP site can be covalently modified by erythrosin isothiocyanata (EITC), sincetheK+-activated p-nitrophenylphosphatse is lost under these conditions. Moreover we became aware that the E2ATP site binds with high affinity the fluorescent DANS-8-N3-ATP. Since this ATP analog is photosensitive, it should be possible to label the E2ATsite by two different fluorescent labels opening up thereby the possibility to localize the amino acids forming the E2ATP site and to determine the distances between both ATP sites by Förster energy transfer measurements.
Keywords
Public support
Provider
Czech Science Foundation
Programme
Standard projects
Call for proposals
—
Main participants
Fyziologický ústav AV ČR, v. v. i.
Contest type
—
Contract ID
—
Alternative language
Project name in Czech
Nízko- a vysokoafinní místa pro ATP na Na+/K+-ATPáze: jejich lokalizace, struktura a dynamika
Annotation in Czech
Na+/K+-ATPáza má dvě ATP vazebná místa, která během katalýzy kooperují negativně na substráty ATP, pozitivně však s MANT-ATP. Vysokoafinní místo pro ATP (E1ATP místo) může být modifikováno fluorescein isothiokyanátem (FITC) kovalentně vázaným na lysin 501. Z poznatků poslední doby je známo, že E2ATP (nízkofinní místo) může být modifikováno kovalentně vázaným erytrosinem isothiokyanátem (ErITC). Zjistili jsme, že na E2ATP vazebné místo se s vysokou afinitou váže také DANS-8-N3-ATP. Díky světelné citlivosti vazby tohoto ATP analogu je možné E2ATP vazebné místo označit dvěmi různými fluorescenčními značkami, což nám, mimo jiné, umožní: 1) Lokalizovat aminokyselinové sekvence tvořící E2ATP vazebné místo. 2) Určit, pomocí Försterova přenosu energie,vzdálenost dvou ATP vazebných míst. Odpověď na tyto dvě otázky je hlavním cílem této práce.
Scientific branches
R&D category
—
CEP classification - main branch
EE - Microbiology, virology
CEP - secondary branch
EB - Genetics and molecular biology
CEP - another secondary branch
—
10603 - Genetics and heredity (medical genetics to be 3)
10604 - Reproductive biology (medical aspects to be 3)
10605 - Developmental biology
10606 - Microbiology
10607 - Virology
10608 - Biochemistry and molecular biology
10609 - Biochemical research methods
30101 - Human genetics
Completed project evaluation
Provider evaluation
V - Vynikající výsledky projektu (s mezinárodním významem atd.)
Project results evaluation
Projekt představuje špičkový výzkum molekulární biologie a biochemie. Získané výsledky jsou v souladu s plány grantového projektu a zasahují do celé řady biologických oborů. Řešení grantu je zakončeno 12 publikacemi (10 již vyšlo, 2 přijaté do tisku). Fo
Solution timeline
Realization period - beginning
Jan 1, 1998
Realization period - end
Jan 1, 2000
Project status
U - Finished project
Latest support payment
—
Data delivery to CEP
Confidentiality
S - Úplné a pravdivé údaje o projektu nepodléhají ochraně podle zvláštních právních předpisů
Data delivery code
CEP/2001/GA0/GA01GA/U/N/9:4
Data delivery date
—
Finance
Total approved costs
1,111 thou. CZK
Public financial support
916 thou. CZK
Other public sources
0 thou. CZK
Non public and foreign sources
0 thou. CZK
Basic information
Recognised costs
1 111 CZK thou.
Public support
916 CZK thou.
82%
Provider
Czech Science Foundation
CEP
EE - Microbiology, virology
Solution period
01. 01. 1998 - 01. 01. 2000