Verification of quantification standards used in real-time PCR using droplet digital PCR

Result code in IS VaVaI

<a href="https://www.isvavai.cz/riv?ss=detail&h=RIV%2F00027162%3A_____%2F18%3AN0000129" target="_blank" >RIV/00027162:_____/18:N0000129 - isvavai.cz</a>

Result on the web

<a href="http://www.med.muni.cz/tomdny/Sbornik-TD-2018-RV2.pdf" target="_blank" >http://www.med.muni.cz/tomdny/Sbornik-TD-2018-RV2.pdf</a>

DOI - Digital Object Identifier

—

Result language

čeština

Original language name

Ověření kvantifikačních standardů využívaných při real-time PCR pomocí droplet digital PCR

Original language description

XXVII. Tomáškovy dny mladých mikrobiologů. V současné době je kvantitativní real-time PCR (qPCR) jedna z nejpoužívanějších molekulárně-biologických metod pro detekci mikrobiálních patogenů. Nevýhodou této metody je však nezbytnost sestrojení kalibrační křivky ze standardů, jež musí být přesně kvantifikovány. V tomto ohledu zatím neexistuje metoda pro nezávislé ověřování kvantifikačních standardů. Nejčastěji se k tomuto účelu využívá spektrofotometrie, avšak spektrofotometrické měření absorbance nukleové kyseliny je ovlivněno její čistotou, což může vést k nesprávnému naředění standardu. Slibným nástrojem pro přesnou kvantifikaci těchto standardů se jeví nedávno vyvinutá metoda droplet digital PCR (ddPCR), která poskytuje absolutní kvantifikaci cílové sekvence nukleové kyseliny bez nutnosti využití kalibrační křivky. Principem metody ddPCR je naředění vzorku a rozdělení reakční směsi do emulze o přibližně 20 000 kapének, které obsahují jednu, více než jednu nebo žádnou kopii cílové nukleové kyseliny. Po amplifikaci jsou kapénky obsahující jednu nebo více kopií molekul na základě fluorescence označeny za pozitivní, zatímco kapénky s žádnou molekulou za negativní. Absolutní počet kopií cílové nukleové kyseliny přítomné ve vzorku je následně vypočítán z množství pozitivních kapének s využitím Poissonovy statistiky. Pomocí ddPCR jsme provedli ověření na čtyřech vybraných kvantifikačních standardech využívaných v našich laboratořích. Předběžné výsledky ukazují, že spektrofotometrické měření absorbance nukleové kyseliny nadhodnocuje o 30–50%. Dále byla porovnána cirkulární a linearizovaná forma těchto standardů. Z výsledků vyplývá, že linearizovaná forma plazmidu je pro standard vhodnější než cirkulární, jelikož je lépe přístupná amplifikaci cílové sekvence nukleové kyseliny. Jako poslední krok budou testovány různé kity na izolaci plazmidové DNA pro zjištění vlivu případné kontaminace.

Czech name

Ověření kvantifikačních standardů využívaných při real-time PCR pomocí droplet digital PCR

Czech description

XXVII. Tomáškovy dny mladých mikrobiologů. V současné době je kvantitativní real-time PCR (qPCR) jedna z nejpoužívanějších molekulárně-biologických metod pro detekci mikrobiálních patogenů. Nevýhodou této metody je však nezbytnost sestrojení kalibrační křivky ze standardů, jež musí být přesně kvantifikovány. V tomto ohledu zatím neexistuje metoda pro nezávislé ověřování kvantifikačních standardů. Nejčastěji se k tomuto účelu využívá spektrofotometrie, avšak spektrofotometrické měření absorbance nukleové kyseliny je ovlivněno její čistotou, což může vést k nesprávnému naředění standardu. Slibným nástrojem pro přesnou kvantifikaci těchto standardů se jeví nedávno vyvinutá metoda droplet digital PCR (ddPCR), která poskytuje absolutní kvantifikaci cílové sekvence nukleové kyseliny bez nutnosti využití kalibrační křivky. Principem metody ddPCR je naředění vzorku a rozdělení reakční směsi do emulze o přibližně 20 000 kapének, které obsahují jednu, více než jednu nebo žádnou kopii cílové nukleové kyseliny. Po amplifikaci jsou kapénky obsahující jednu nebo více kopií molekul na základě fluorescence označeny za pozitivní, zatímco kapénky s žádnou molekulou za negativní. Absolutní počet kopií cílové nukleové kyseliny přítomné ve vzorku je následně vypočítán z množství pozitivních kapének s využitím Poissonovy statistiky. Pomocí ddPCR jsme provedli ověření na čtyřech vybraných kvantifikačních standardech využívaných v našich laboratořích. Předběžné výsledky ukazují, že spektrofotometrické měření absorbance nukleové kyseliny nadhodnocuje o 30–50%. Dále byla porovnána cirkulární a linearizovaná forma těchto standardů. Z výsledků vyplývá, že linearizovaná forma plazmidu je pro standard vhodnější než cirkulární, jelikož je lépe přístupná amplifikaci cílové sekvence nukleové kyseliny. Jako poslední krok budou testovány různé kity na izolaci plazmidové DNA pro zjištění vlivu případné kontaminace.

Type

O - Miscellaneous

CEP classification

—

OECD FORD branch

10608 - Biochemistry and molecular biology

Project

<a href="/en/project/QK1810212" target="_blank" >QK1810212: Rapid, complex and multiplex methods for simultaneous detection of food-borne pathogens in food of animal and plant origin</a><br>

Continuities

P - Projekt vyzkumu a vyvoje financovany z verejnych zdroju (s odkazem do CEP)<br>I - Institucionalni podpora na dlouhodoby koncepcni rozvoj vyzkumne organizace

Publication year

2018

Confidentiality

S - Úplné a pravdivé údaje o projektu nepodléhají ochraně podle zvláštních právních předpisů