OPTIMIZATION OF IN-VITRO DIFFERENTIATION AND ACTIVATION OF MONOCYTES BEFORE THE ANALYSIS OF PLAUR GENE EXPRESSION

Result code in IS VaVaI

<a href="https://www.isvavai.cz/riv?ss=detail&h=RIV%2F00216224%3A14110%2F22%3A00129722" target="_blank" >RIV/00216224:14110/22:00129722 - isvavai.cz</a>

Result on the web

—

DOI - Digital Object Identifier

—

Result language

čeština

Original language name

OPTIMALIZÁCIA IN VITRO DIFERENCIÁCIE A AKTIVÁCIE MONOCYTOV PRED ANALÝZOU EXPRESIE GÉNU PLAUR

Original language description

Cieľom práce bola optimalizácia procesu izolácie, diferenciácie a aktivácie monocytov. Snahou bolo dosiahnuť maximálne výťažky monocytov z odberu periférnej krvi, ich vysokú čistotu a najnižšiu možnú primárnu aktiváciu buniek. Výberom vhodnej koncentrácie cytokínov a inkubačnej doby sme sa snažili docieliť in-vitro diferenciáciu monocytov do makrofágov typu M1. V aktivovaných a plne diferencovaných monocytoch u pacientov s hereditárnym angioedémom, astmou a reumatoídnou artritídou bude následne sledovaná expresia génu PLAUR. Gén PLAUR kóduje proteín uPAR (CD87) ovplyvňujúci fibrinolýzu po jeho interakcii s urokinázovým aktivátorom plasminogénu (uPA), zrážanlivosť krvi a produkciu bradikinínu väzbou na FXII, ktorý sa aktivuje na povrchu buniek a moduluje bunečnú adhezivitu a migráciu cez interakcie s proteínmi extracelulárneho matrix. Z odberu periférnej krvi boli monocyty izolované metódou magnetickej separácie. Získané monocyty boli diferencované kombináciou cytokínov M-CSF a INFγ, ktoré podporili diferenciáciu do M1 makrofágov. Čistota izolovaných monocytov, ich diferenciácia a aktivácia bola stanovená mikroskopicky a pomocou prietokovej cytometrie. Vyššie výťažky monocytov boli dosiahnuté použitím dvojnásobne koncentrovaného roztoku PBS pričom sa priemerný výťažok monocytov pohyboval okolo 150 000 buniek z 1 ml periférnej krvi s čistotou nad 95 %. Nízka aktivácia monocytov bola docielená pri použití sklenených skúmaviek a udržaním nízkej teploty (&lt; 8 ºC) bunečnej suspenzie počas celého procesu izolácie. Mikroskopickým pozorovaním bola stanovená najvhodnejšia dĺžka inkubácie monocytov a koncentrácie cytokínov MCSF a INFg, Diferenciácia a aktivácia monocytov bola stanovená meraniami na prietokovom cytometri na základe zvýšenej povrchovej expresie markerov CD86, CD38 a CCR7. Takto diferencované a aktivované monocyty sa ukázali byť vhodné pre ďalšie spracovanie. Výsledkom prevedených pokusov je optimalizovaný a verifikovaný postup izolácie a aktivácie monocytov potrebný na presnú analýzu expresie génu PLAUR.

Czech name

OPTIMALIZÁCIA IN VITRO DIFERENCIÁCIE A AKTIVÁCIE MONOCYTOV PRED ANALÝZOU EXPRESIE GÉNU PLAUR

Czech description

Cieľom práce bola optimalizácia procesu izolácie, diferenciácie a aktivácie monocytov. Snahou bolo dosiahnuť maximálne výťažky monocytov z odberu periférnej krvi, ich vysokú čistotu a najnižšiu možnú primárnu aktiváciu buniek. Výberom vhodnej koncentrácie cytokínov a inkubačnej doby sme sa snažili docieliť in-vitro diferenciáciu monocytov do makrofágov typu M1. V aktivovaných a plne diferencovaných monocytoch u pacientov s hereditárnym angioedémom, astmou a reumatoídnou artritídou bude následne sledovaná expresia génu PLAUR. Gén PLAUR kóduje proteín uPAR (CD87) ovplyvňujúci fibrinolýzu po jeho interakcii s urokinázovým aktivátorom plasminogénu (uPA), zrážanlivosť krvi a produkciu bradikinínu väzbou na FXII, ktorý sa aktivuje na povrchu buniek a moduluje bunečnú adhezivitu a migráciu cez interakcie s proteínmi extracelulárneho matrix. Z odberu periférnej krvi boli monocyty izolované metódou magnetickej separácie. Získané monocyty boli diferencované kombináciou cytokínov M-CSF a INFγ, ktoré podporili diferenciáciu do M1 makrofágov. Čistota izolovaných monocytov, ich diferenciácia a aktivácia bola stanovená mikroskopicky a pomocou prietokovej cytometrie. Vyššie výťažky monocytov boli dosiahnuté použitím dvojnásobne koncentrovaného roztoku PBS pričom sa priemerný výťažok monocytov pohyboval okolo 150 000 buniek z 1 ml periférnej krvi s čistotou nad 95 %. Nízka aktivácia monocytov bola docielená pri použití sklenených skúmaviek a udržaním nízkej teploty (&lt; 8 ºC) bunečnej suspenzie počas celého procesu izolácie. Mikroskopickým pozorovaním bola stanovená najvhodnejšia dĺžka inkubácie monocytov a koncentrácie cytokínov MCSF a INFg, Diferenciácia a aktivácia monocytov bola stanovená meraniami na prietokovom cytometri na základe zvýšenej povrchovej expresie markerov CD86, CD38 a CCR7. Takto diferencované a aktivované monocyty sa ukázali byť vhodné pre ďalšie spracovanie. Výsledkom prevedených pokusov je optimalizovaný a verifikovaný postup izolácie a aktivácie monocytov potrebný na presnú analýzu expresie génu PLAUR.

Type

O - Miscellaneous

CEP classification

—

OECD FORD branch

30102 - Immunology

Project

<a href="/en/project/NU21-05-00438" target="_blank" >NU21-05-00438: The role of uPAR alternative isoforms in immunopathological response</a><br>

Continuities

P - Projekt vyzkumu a vyvoje financovany z verejnych zdroju (s odkazem do CEP)

Publication year

2022

Confidentiality

S - Úplné a pravdivé údaje o projektu nepodléhají ochraně podle zvláštních právních předpisů