Quantitative analysis of mRNA coding (sub) isoforms of metallothioneins in breast cancer cell lines after application of cytostatic drugs

Result code in IS VaVaI

<a href="https://www.isvavai.cz/riv?ss=detail&h=RIV%2F62156489%3A43210%2F20%3A43918791" target="_blank" >RIV/62156489:43210/20:43918791 - isvavai.cz</a>

Result on the web

<a href="https://www.onkologickedny.cz/f/data/documents/11339-sbornik-ebod.pdf" target="_blank" >https://www.onkologickedny.cz/f/data/documents/11339-sbornik-ebod.pdf</a>

DOI - Digital Object Identifier

—

Result language

čeština

Original language name

Kvantitativní analýza mRNA kódující (sub)izoformy metalothioneinů v buňkách karcinomu prsu po aplikaci cytostatických léčiv

Original language description

Metalothioneiny (MT) jsou proteiny s nízkou molekulovou hmotností. MT je velmi bohaté na cystein, což způsobuje vysokou afinitu MT k těžkým kovům a poskytuje buňkám ochranu proti jejich toxickému účinku. MT tak primárně řídí intracelulární homeostázu zinku, která je nezbytná pro buněčnou proliferaci a diferenciaci. MT působí také jako antioxidant chránící buňky před volnými radikály a následným oxidačním stresem. Dosud byly detekovány čtyři transkripčně aktivní izoformy a osm (sub)izoforem MT, jejichž exprese je tkáňově specifická. Mnoho studií uvádí, že exprese jednotlivých MT se liší u různých typů nádorů, což naznačuje, že MT hrají zásadní roli v procesu karcinogeneze. Identifikace změn v expresi jednotlivých (sub)izoforem MT by tak mohla mimo jiné přispět k časné diagnóze nádoru a efektivnější terapii. Pro experimenty byly využity prsní nádorové linie MDA-231, MDA-468 a MCF-7. Byl proveden MTT test pro zjištění poloviční inhibiční koncentrace jednotlivých cytostatických léčiv (cisplatina, doxorubicin) pro každou z buněčných linií. Poté byla provedena inkubace se stanovenými koncentracemi testovaných látek. Po 24 hod byla izolována RNA, následovaná reverzní transkripcí. Přepsaná cDNA sloužila jako templát pro kvantitativní polymerázovou řetězcovou reakci qPCR. Sledovány byly exprese jednotlivých genů pro následující subizoformy MT: MT1A, MT1E, MT1F, MT1G, MT1X, MT2A a MT3. Výsledky byly vyhodnoceny metodou 2-ΔΔCt. Specificita PCR byla validována analýzou křivek tání amplifikačních produktů. Byly zjištěny poloviční inhibiční koncentrace pro jednotlivé buněčné linie. 24hIC50 cisplatiny byla 115μM pro MDA-MB-231, 14μM pro MDA-MB-468 a 52μM pro MCF-7. 24hIC50 doxorubicinu byla 230 μM pro MDA-MB-231, 3μM pro MDA-MB-468 a 10μM pro MCF-7. Následovala samotná kvantitativní analýza jednotlivých MT u vybraných nádorových buněčných linií. Po inkubaci s cytostatickými léčivy došlo ke změně expresních profilů MT1A, MT1E, MT1F, MT1G a MT1X u všech zkoumaných buněčných linií. Zvýšení bylo pozorováno obzvláště u genu MT3, který je u těchto buněčných linií za normálních podmínek exprimován pouze v zanedbatelné míře. Výsledky této studie potvrzují, že exprese (sub)izoforem MT je specificky zvyšována aplikací cytostatických léčiv, a může tak hrát důležitou roli v procesu rozvoje chemorezistence. Dalším krokem budou funkční analýzy jednotlivých (sub)izoforem (knock-in, knock-out) a identifikace konkrétních mechanizmů zodpovědných nejen za dysregulaci exprese MT, ale také za rozvoj chemorezistence.

Czech name

Kvantitativní analýza mRNA kódující (sub)izoformy metalothioneinů v buňkách karcinomu prsu po aplikaci cytostatických léčiv

Czech description

Metalothioneiny (MT) jsou proteiny s nízkou molekulovou hmotností. MT je velmi bohaté na cystein, což způsobuje vysokou afinitu MT k těžkým kovům a poskytuje buňkám ochranu proti jejich toxickému účinku. MT tak primárně řídí intracelulární homeostázu zinku, která je nezbytná pro buněčnou proliferaci a diferenciaci. MT působí také jako antioxidant chránící buňky před volnými radikály a následným oxidačním stresem. Dosud byly detekovány čtyři transkripčně aktivní izoformy a osm (sub)izoforem MT, jejichž exprese je tkáňově specifická. Mnoho studií uvádí, že exprese jednotlivých MT se liší u různých typů nádorů, což naznačuje, že MT hrají zásadní roli v procesu karcinogeneze. Identifikace změn v expresi jednotlivých (sub)izoforem MT by tak mohla mimo jiné přispět k časné diagnóze nádoru a efektivnější terapii. Pro experimenty byly využity prsní nádorové linie MDA-231, MDA-468 a MCF-7. Byl proveden MTT test pro zjištění poloviční inhibiční koncentrace jednotlivých cytostatických léčiv (cisplatina, doxorubicin) pro každou z buněčných linií. Poté byla provedena inkubace se stanovenými koncentracemi testovaných látek. Po 24 hod byla izolována RNA, následovaná reverzní transkripcí. Přepsaná cDNA sloužila jako templát pro kvantitativní polymerázovou řetězcovou reakci qPCR. Sledovány byly exprese jednotlivých genů pro následující subizoformy MT: MT1A, MT1E, MT1F, MT1G, MT1X, MT2A a MT3. Výsledky byly vyhodnoceny metodou 2-ΔΔCt. Specificita PCR byla validována analýzou křivek tání amplifikačních produktů. Byly zjištěny poloviční inhibiční koncentrace pro jednotlivé buněčné linie. 24hIC50 cisplatiny byla 115μM pro MDA-MB-231, 14μM pro MDA-MB-468 a 52μM pro MCF-7. 24hIC50 doxorubicinu byla 230 μM pro MDA-MB-231, 3μM pro MDA-MB-468 a 10μM pro MCF-7. Následovala samotná kvantitativní analýza jednotlivých MT u vybraných nádorových buněčných linií. Po inkubaci s cytostatickými léčivy došlo ke změně expresních profilů MT1A, MT1E, MT1F, MT1G a MT1X u všech zkoumaných buněčných linií. Zvýšení bylo pozorováno obzvláště u genu MT3, který je u těchto buněčných linií za normálních podmínek exprimován pouze v zanedbatelné míře. Výsledky této studie potvrzují, že exprese (sub)izoforem MT je specificky zvyšována aplikací cytostatických léčiv, a může tak hrát důležitou roli v procesu rozvoje chemorezistence. Dalším krokem budou funkční analýzy jednotlivých (sub)izoforem (knock-in, knock-out) a identifikace konkrétních mechanizmů zodpovědných nejen za dysregulaci exprese MT, ale také za rozvoj chemorezistence.

Type

O - Miscellaneous

CEP classification

—

OECD FORD branch

10601 - Cell biology

Project

<a href="/en/project/GC19-13766J" target="_blank" >GC19-13766J: Zinc signaling and metallothioneins sub/isoforms expression in breast cancer: implications for prognostic and therapeutic purposes</a><br>

Continuities

P - Projekt vyzkumu a vyvoje financovany z verejnych zdroju (s odkazem do CEP)

Publication year

2020

Confidentiality

S - Úplné a pravdivé údaje o projektu nepodléhají ochraně podle zvláštních právních předpisů