Sensitivity of the most important periodontal pathogens of dogs to silver nanoparticles

Result code in IS VaVaI

<a href="https://www.isvavai.cz/riv?ss=detail&h=RIV%2F62157124%3A16170%2F23%3A43881075" target="_blank" >RIV/62157124:16170/23:43881075 - isvavai.cz</a>

Result on the web

<a href="https://www.vfu.cz/files/upload/693/Sbornik_IGA_2023.pdf" target="_blank" >https://www.vfu.cz/files/upload/693/Sbornik_IGA_2023.pdf</a>

DOI - Digital Object Identifier

—

Result language

čeština

Original language name

Citlivost nejvýznamnějších parodontopatogenů psa k nanočásticím stříbra

Original language description

Onemocnění parodontu je nejčastěji diagnostikovaným onemocněním v klinické praxi psů a koček. Jelikož se zprvu neprojevuje závažnými klinickými příznaky, k jeho řešení často dochází až v pokročilých stavech. Parodontitida může vyústit v oronasální fistuly, endodontické onemocnění, patologické fraktury čelisti, onemocnění očí nebo osteomyelitidu. Parodontální onemocnění ale ovlivňuje i jiné orgánové systémy. Negativně ovlivňuje například funkci ledvin, jater, srdce nebo plic (Niemec, 2008). Parodontální onemocnění je výsledkem interakcí bakterií zubního plaku a imunitního systému pacienta. Bakterie se zachycují a množí v zubním plaku, následně produkují toxiny, které poškozují závěsný aparát zubu. U lidí je hlavním parodontopatogenem bakterie Porphyromonas gingivalis. U psů a koček bývá vykultivována P. gulae (Fournier, 2001) a další druhy. Imunitní systém hostitele reaguje na přítomnost bakterií vysláním neutrofilů, které bakterie pohlcují a rozkládají. Při tom dochází k uvolňování bakteriálních toxinů a destruktivních enzymů, které nadále přispívají k destrukci parodontu (Reiter and Harvey, 2010).V posledních letech vznikly studie, které zkoumaly složení bakterií v zubním plaku u psů s parodontitidou metodou PCR. Nejčastěji byly prokázány následující bakterie: Porphyromonas gingivalis (88-100 %), Prevotella nigrescens (57 %), Porphyromonas gulae (39 %). Výsledky studií se značně liší v případě bakterie Tannerella forsythia (4 % vs. 100 %). Jedna ze studií také zmiňuje výskyt bakterií rodu Treponema spp. (64 %), jednalo se o bakterie Treponema denticola (28,5 %) a Treponema putidum (42,9 %). Soubor těchto bakterií je tedy nyní dáván do souvislosti s parodontitidou psa. Nicméně některé z těchto druhů lze kultivovat také ze psů, kteří nemají klinické příznaky parodontálního onemocnění (Kačírová et al, 2022; Özavci, 2019). Terapií parodontálního onemocnění je profesionální čištění zubů (odstranění supragingiválního i subgingválního zubního plaku, leštění zubní skloviny) provedené v celkové anestezii veterinárním lékařem. Na to však musí navazovat denní domácí péče ze strany majitele. Jako nejefektivnější se ukázalo denní čištění zubů vhodným zubním kartáčkem, jehož důsledkem je při pravidelném a řádném provedení redukce zubního plaku. Jedná se tak o prevenci progrese parodontálního onemocnění.Naše zkušenost z klinické praxe je taková, že majitelé nejsou v preventivním čištění zubů důslední. Pravidelné odstranění zubního plaku nahradit nelze, nicméně rádi bychom samotné čištění doplnili další metodou, která by snahu majitelů podpořila. Nanočástice stříbra mají obecně antiseptický účinek. Jejich roztoky by tedy měly mít inhibiční případně i baktericidní účinek na bakterie kolonizující dutinu ústní psa, včetně těch, které považujeme za parodontopatogeny.(i) Studie výskytu bakterií, které jsou považovány za parodontopatogeny.U obou skupin (psi trpící parodontitidou a psi bez klinických příznaků parodontitidy) byly odebírány vzorky zubního plaku sterilními papírovým čepy a tampony a byly přeneseny do 0,5 ml redukovaného pufru ve zkumavce typu Eppendorf. V pufru byly vzorky po dobu 1 minuty homogenizovány intenzivním třením tamponu o stěnu zkumavky a do 30 minut byly přeneseny ke kultivačnímu vyšetření, které probíhalo v anaerobním boxu. Jeden díl vzorku byl v anaerobním boxu přenesen do sterilní redukované plastové zkumavky a následně zamražen a uchováván při -80 °C pro zjištění druhového zastoupení bakterií metagonomickým vyšetřením. Druhý díl vzorku byl zpracován kultivačně s využitím selektivních anaerobních agarů vhodných k izolaci bakterií z rodu Porphyromonas a Prevotella. Získané izoláty byly subkultivovány, identifikovány hmotnostní spektrometrií MALDI TOF (Bruker, Německo) a uchovány v anaerobním kryoprotektivním médiu při -80 °C pro další analýzy. Z uchovaných vzorků byla pomocí NucleoSpin®Tissue Kit (Roche) izolovaná DNA. Tato byla následně použita jako templát pro RT PCR. Pro každý vzorek bylo připraveno 5 PCR – jedna pro každý druh bakterie. RT PCR následně proběhla v LightCycler® 480 (Roche).(ii) Stanovení citlivosti izolátů vůči nanočásticím stříbra in vitroVybrané izoláty bakterií z rodu Porphyromonas a Prevotella jsou testovány mikrodiluční metodou na citlivost vůči nanočásticím stříbra. Ke stanovení citlivosti jsou využity metodiky mikrodilučního stanovení MIC a MBC (VET01, CLSI, 2020). Výchozí roztok nano stříbra (5000 p.p.m.) ve Wilkins-Chalgrenově bujónu (Oxoid, VB) v redukovaných mikrotitračních destičkách a zaočkován multiinokulátorem na denzitu 1 x 105 KTJ příslušného bakteriálního kmene včetně typového kmene Porphyromonas gingivalis. Hodnoty MIC budou odečteny jako nejnižší koncentrace potlačující množení testované kultury.(iii) Stanovení citlivosti ke koloidnímu roztoku nanočástic stříbra in vivoMajitelé psů, u kterých byl takto vzorek odebrán, aplikovali po adekvátním parodontálním ošetření komerční mukoadhezivní gel podle instrukcí příbalového letáku. Kontrolní stěr dásní a zubů za účelem ověření přítomnosti sledovaných parodontopatogenů metodou RT PCR byl proveden po 4 týdnech.Celkem bylo prozatím otestováno 25 psů obou pohlaví, různého věku a patřícím k různým plemenům (20 s parodontitidou, 5 bez klinických příznaků. Testy některých odebraných vzorků pro dlouhodobou kultivaci zatím ještě probíhají a nemohly být vyhodnoceny.Majitelé psů ze skupiny s onemocněním parodontu, kteří souhlasili s účástí na tomto projektu, aplikovali po adekvátním parodontálním ošetření psa komerční mukoadhezivní gel podle instrukcí příbalového letáku. Kontrolní stěr dásní a zubů za účelem kultivačního průkazu parodontopatogenů byl proveden po 4 týdnech, pokud se dostavili na přislíbenou kontrolu.Hodnocení výsledků stanovení citlivosti izolátů vůči nanočásticím stříbra in vitro nebylo doposud ukončeno. Komerčně vyráběné mukoadhezivní gely obsahují 0,02 % nanočástic stříbra.Kultivačně se podařilo u psů s parodontálním onemocněním prozatím prokázat přítomnost Porphyromonas gulae, Porphyromonas macacae, Prevotella nigrificans a Veilonella parvula. U části psů s parodontálním onemocněním kultivace námi hledané bakterie neodhalila. Kvantifikace při kultivaci naznačuje, že se zvyšujícím se stupněm parodontitidy, se také zvyšuje počet bakterií daného druhu. U kontrolní skupiny byla provedena kontrola metodou RT PCR.Metodou RT PCR jsme ve vzorcích vyšetřovali přítomnost bakterií Tanerella forsythia, Treponema denticola, Prevotella nigriscens a bakerie rodu Porphyromonas. Výskyt bakterie Tanerella forsythia byl prozatím potvrzen u 18 pacientů (14 psů s parodontálním onemocněním, 4 psi z kontrolní skupiny). Po aplikaci gelu bylo vyšetření prozatím zopakováno u 4 pacientů. U všech se tato bakterie v dutině ústní nadále vyskytovala. Přítomnost bakterie Treponema denticola byla metodou RT PCR zjištěna prozatím u 8 testovaných psů (7 psů s parodontálním onemocněním, 1 pes z kontrolní skupiny) z nichž kontrolní odběr doposud absolvoval jeden pes – s negativním výsledkem. Prevotella nigriscens byla detekována u 6 psů (5 psů s parodontálním onemocněním, 1 pes z kontrolní skupiny). Na kontrolní odběr se z těchto psů prozatím dostavil 1–s negativním výsledkem. Bakterie z rodu Porphyromonas byly metodou PCR detekovány u 6 psů (5 psů s parodontálním onemocněním, 1 pes z kontrolní skupiny). Vyšetření kontrolních stěrů pozitivních psů prozatím nemáme k dispozici.U všech psů, kteří trpí parodontálním onemocněním se nám kultivačně, nebo pomocí PCR podařilo potvrdit přítomnost bakterií, které dle aktuální literatury mohou parodontitidu způsobovat. Se zvyšujícím se stupněm parodontitidy pozorujeme ve výsledcích zvyšující se počet kolonií stanovovaných bakterií (kultivace). U psů trpících parodontitidou pozorujeme častěji kombinace více sledovaných bakterií. Pokud se tyto bakterie objevili v kontrolní skupině, jednalo se většinou o nález pouze jednoho sledovaného druhu. V případě jednoho psa z kontrolní skupiny se vyskytovaly dva různé druhy bakterií. Nanočástice stříbra se v dekolonizaci těchto bakterií z dutin ústní psů jeví slibně, nicméně potřebujeme více času pro odběr kontrolních vzorků (náročnost kultivace) a nasbírání více pacientů do studie. Pouze bakterie Tanerella forsythia se po aplikaci stále vyskytovala ve všech kontrolních vzorcích a použití nanočástic stříbra na její odstranění z dutiny ústní nejspíš nemá vliv.

Czech name

Citlivost nejvýznamnějších parodontopatogenů psa k nanočásticím stříbra

Czech description

Onemocnění parodontu je nejčastěji diagnostikovaným onemocněním v klinické praxi psů a koček. Jelikož se zprvu neprojevuje závažnými klinickými příznaky, k jeho řešení často dochází až v pokročilých stavech. Parodontitida může vyústit v oronasální fistuly, endodontické onemocnění, patologické fraktury čelisti, onemocnění očí nebo osteomyelitidu. Parodontální onemocnění ale ovlivňuje i jiné orgánové systémy. Negativně ovlivňuje například funkci ledvin, jater, srdce nebo plic (Niemec, 2008). Parodontální onemocnění je výsledkem interakcí bakterií zubního plaku a imunitního systému pacienta. Bakterie se zachycují a množí v zubním plaku, následně produkují toxiny, které poškozují závěsný aparát zubu. U lidí je hlavním parodontopatogenem bakterie Porphyromonas gingivalis. U psů a koček bývá vykultivována P. gulae (Fournier, 2001) a další druhy. Imunitní systém hostitele reaguje na přítomnost bakterií vysláním neutrofilů, které bakterie pohlcují a rozkládají. Při tom dochází k uvolňování bakteriálních toxinů a destruktivních enzymů, které nadále přispívají k destrukci parodontu (Reiter and Harvey, 2010).V posledních letech vznikly studie, které zkoumaly složení bakterií v zubním plaku u psů s parodontitidou metodou PCR. Nejčastěji byly prokázány následující bakterie: Porphyromonas gingivalis (88-100 %), Prevotella nigrescens (57 %), Porphyromonas gulae (39 %). Výsledky studií se značně liší v případě bakterie Tannerella forsythia (4 % vs. 100 %). Jedna ze studií také zmiňuje výskyt bakterií rodu Treponema spp. (64 %), jednalo se o bakterie Treponema denticola (28,5 %) a Treponema putidum (42,9 %). Soubor těchto bakterií je tedy nyní dáván do souvislosti s parodontitidou psa. Nicméně některé z těchto druhů lze kultivovat také ze psů, kteří nemají klinické příznaky parodontálního onemocnění (Kačírová et al, 2022; Özavci, 2019). Terapií parodontálního onemocnění je profesionální čištění zubů (odstranění supragingiválního i subgingválního zubního plaku, leštění zubní skloviny) provedené v celkové anestezii veterinárním lékařem. Na to však musí navazovat denní domácí péče ze strany majitele. Jako nejefektivnější se ukázalo denní čištění zubů vhodným zubním kartáčkem, jehož důsledkem je při pravidelném a řádném provedení redukce zubního plaku. Jedná se tak o prevenci progrese parodontálního onemocnění.Naše zkušenost z klinické praxe je taková, že majitelé nejsou v preventivním čištění zubů důslední. Pravidelné odstranění zubního plaku nahradit nelze, nicméně rádi bychom samotné čištění doplnili další metodou, která by snahu majitelů podpořila. Nanočástice stříbra mají obecně antiseptický účinek. Jejich roztoky by tedy měly mít inhibiční případně i baktericidní účinek na bakterie kolonizující dutinu ústní psa, včetně těch, které považujeme za parodontopatogeny.(i) Studie výskytu bakterií, které jsou považovány za parodontopatogeny.U obou skupin (psi trpící parodontitidou a psi bez klinických příznaků parodontitidy) byly odebírány vzorky zubního plaku sterilními papírovým čepy a tampony a byly přeneseny do 0,5 ml redukovaného pufru ve zkumavce typu Eppendorf. V pufru byly vzorky po dobu 1 minuty homogenizovány intenzivním třením tamponu o stěnu zkumavky a do 30 minut byly přeneseny ke kultivačnímu vyšetření, které probíhalo v anaerobním boxu. Jeden díl vzorku byl v anaerobním boxu přenesen do sterilní redukované plastové zkumavky a následně zamražen a uchováván při -80 °C pro zjištění druhového zastoupení bakterií metagonomickým vyšetřením. Druhý díl vzorku byl zpracován kultivačně s využitím selektivních anaerobních agarů vhodných k izolaci bakterií z rodu Porphyromonas a Prevotella. Získané izoláty byly subkultivovány, identifikovány hmotnostní spektrometrií MALDI TOF (Bruker, Německo) a uchovány v anaerobním kryoprotektivním médiu při -80 °C pro další analýzy. Z uchovaných vzorků byla pomocí NucleoSpin®Tissue Kit (Roche) izolovaná DNA. Tato byla následně použita jako templát pro RT PCR. Pro každý vzorek bylo připraveno 5 PCR – jedna pro každý druh bakterie. RT PCR následně proběhla v LightCycler® 480 (Roche).(ii) Stanovení citlivosti izolátů vůči nanočásticím stříbra in vitroVybrané izoláty bakterií z rodu Porphyromonas a Prevotella jsou testovány mikrodiluční metodou na citlivost vůči nanočásticím stříbra. Ke stanovení citlivosti jsou využity metodiky mikrodilučního stanovení MIC a MBC (VET01, CLSI, 2020). Výchozí roztok nano stříbra (5000 p.p.m.) ve Wilkins-Chalgrenově bujónu (Oxoid, VB) v redukovaných mikrotitračních destičkách a zaočkován multiinokulátorem na denzitu 1 x 105 KTJ příslušného bakteriálního kmene včetně typového kmene Porphyromonas gingivalis. Hodnoty MIC budou odečteny jako nejnižší koncentrace potlačující množení testované kultury.(iii) Stanovení citlivosti ke koloidnímu roztoku nanočástic stříbra in vivoMajitelé psů, u kterých byl takto vzorek odebrán, aplikovali po adekvátním parodontálním ošetření komerční mukoadhezivní gel podle instrukcí příbalového letáku. Kontrolní stěr dásní a zubů za účelem ověření přítomnosti sledovaných parodontopatogenů metodou RT PCR byl proveden po 4 týdnech.Celkem bylo prozatím otestováno 25 psů obou pohlaví, různého věku a patřícím k různým plemenům (20 s parodontitidou, 5 bez klinických příznaků. Testy některých odebraných vzorků pro dlouhodobou kultivaci zatím ještě probíhají a nemohly být vyhodnoceny.Majitelé psů ze skupiny s onemocněním parodontu, kteří souhlasili s účástí na tomto projektu, aplikovali po adekvátním parodontálním ošetření psa komerční mukoadhezivní gel podle instrukcí příbalového letáku. Kontrolní stěr dásní a zubů za účelem kultivačního průkazu parodontopatogenů byl proveden po 4 týdnech, pokud se dostavili na přislíbenou kontrolu.Hodnocení výsledků stanovení citlivosti izolátů vůči nanočásticím stříbra in vitro nebylo doposud ukončeno. Komerčně vyráběné mukoadhezivní gely obsahují 0,02 % nanočástic stříbra.Kultivačně se podařilo u psů s parodontálním onemocněním prozatím prokázat přítomnost Porphyromonas gulae, Porphyromonas macacae, Prevotella nigrificans a Veilonella parvula. U části psů s parodontálním onemocněním kultivace námi hledané bakterie neodhalila. Kvantifikace při kultivaci naznačuje, že se zvyšujícím se stupněm parodontitidy, se také zvyšuje počet bakterií daného druhu. U kontrolní skupiny byla provedena kontrola metodou RT PCR.Metodou RT PCR jsme ve vzorcích vyšetřovali přítomnost bakterií Tanerella forsythia, Treponema denticola, Prevotella nigriscens a bakerie rodu Porphyromonas. Výskyt bakterie Tanerella forsythia byl prozatím potvrzen u 18 pacientů (14 psů s parodontálním onemocněním, 4 psi z kontrolní skupiny). Po aplikaci gelu bylo vyšetření prozatím zopakováno u 4 pacientů. U všech se tato bakterie v dutině ústní nadále vyskytovala. Přítomnost bakterie Treponema denticola byla metodou RT PCR zjištěna prozatím u 8 testovaných psů (7 psů s parodontálním onemocněním, 1 pes z kontrolní skupiny) z nichž kontrolní odběr doposud absolvoval jeden pes – s negativním výsledkem. Prevotella nigriscens byla detekována u 6 psů (5 psů s parodontálním onemocněním, 1 pes z kontrolní skupiny). Na kontrolní odběr se z těchto psů prozatím dostavil 1–s negativním výsledkem. Bakterie z rodu Porphyromonas byly metodou PCR detekovány u 6 psů (5 psů s parodontálním onemocněním, 1 pes z kontrolní skupiny). Vyšetření kontrolních stěrů pozitivních psů prozatím nemáme k dispozici.U všech psů, kteří trpí parodontálním onemocněním se nám kultivačně, nebo pomocí PCR podařilo potvrdit přítomnost bakterií, které dle aktuální literatury mohou parodontitidu způsobovat. Se zvyšujícím se stupněm parodontitidy pozorujeme ve výsledcích zvyšující se počet kolonií stanovovaných bakterií (kultivace). U psů trpících parodontitidou pozorujeme častěji kombinace více sledovaných bakterií. Pokud se tyto bakterie objevili v kontrolní skupině, jednalo se většinou o nález pouze jednoho sledovaného druhu. V případě jednoho psa z kontrolní skupiny se vyskytovaly dva různé druhy bakterií. Nanočástice stříbra se v dekolonizaci těchto bakterií z dutin ústní psů jeví slibně, nicméně potřebujeme více času pro odběr kontrolních vzorků (náročnost kultivace) a nasbírání více pacientů do studie. Pouze bakterie Tanerella forsythia se po aplikaci stále vyskytovala ve všech kontrolních vzorcích a použití nanočástic stříbra na její odstranění z dutiny ústní nejspíš nemá vliv.

Type

D - Article in proceedings

CEP classification

—

OECD FORD branch

40301 - Veterinary science

Project

—

Continuities

S - Specificky vyzkum na vysokych skolach

Publication year

2023

Confidentiality

S - Úplné a pravdivé údaje o projektu nepodléhají ochraně podle zvláštních právních předpisů

Article name in the collection

SBORNÍK PŘÍSPĚVKŮ z výsledků řešení projektů IGA VETUNI Brno 2023 financovaných z prostředků účelové podpory na specifický vysokoškolský výzkum MŠMT na rok 2023

ISBN

978-80-7305-946-0

ISSN

—

e-ISSN

—

Number of pages

4

Pages from-to

16-19

Publisher name

Veterinární univerzita Brno

Place of publication

Brno

Event location

Brno

Event date

Dec 12, 2023

Type of event by nationality

CST - Celostátní akce

UT code for WoS article

—