Detection of tick-borne encephalitis virus subtypes by RT-qPCR

Result code in IS VaVaI

<a href="https://www.isvavai.cz/riv?ss=detail&h=RIV%2F70565813%3A_____%2F15%3A%230000519" target="_blank" >RIV/70565813:_____/15:#0000519 - isvavai.cz</a>

Result on the web

—

DOI - Digital Object Identifier

—

Result language

čeština

Original language name

Detekce podtypů viru klíšťové encefalitidy metodou RT-qPCR

Original language description

Virus klíšťové encefalitidy (tick-borne encephalitis virus, TBEV) je řazen do rodu Flavivirus a je původcem závažných onemocnění mozku v Evropě a Asii. Genom kóduje jediný polyprotein, který je následně rozštěpen na tři strukturní proteiny - C, prM a E - a sedm nestrukturních proteinů - NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B a NS5. Na základě sekvence kódující protein E je možno dále rozdělit TBEV na tři podtypy - evropský, dálného východu a sibiřský. Jednotlivé podtypy se liší nejen lokalitou výskytu, ale hlavně průběhem onemocnění a vektorem přenášejícím daný podtyp. Zejména v evropské části Ruska a v Pobaltí se vyskytují všechny tři podtypy, proto je kladen důraz na rozlišení jednotlivých podtypů zvláště kvůli různému průběhu a závažnosti způsobeného onemocnění. Jelikož je navíc pozorován stoupající trend tohoto onemocnění, klade si metodika za cíl nejen detekci všech podtypů v jedné reakci, ale také jejich diferenciaci pomocí metody kvantitativní PCR v reálném čase. Pro zpracování metodiky byly prostudovány dostupné celogenomové sekvence viru - 27 pro evropský podtyp, 71 pro podtyp dálného východu a 23 pro sibiřský podtyp. Poté byly navrženy degenerované primery, schopné zachytit všechny tři podtypy v jedné reakci, do cílového místa kódujícího protein E. Výsledkem je produkt o délce 173 bp, jehož specificita byla ověřena jak gelovou elektroforézou, tak analýzou teplot tání produktu. Aby byla zajištěna specificita detekce pouze pro TBEV, byly analyzovány i příbuzné viry. Na základě dostupných sekvencí se podařilo navrhnout vhodné primery, které jsou schopné selektivně detekovat pouze TBEV. V následných analýzách byla ověřena specificita reakce. Výsledkem je reakce, kterou lze stanovit daný podtyp TBEV pomocí analýzy teplot tání PCR produktu. Navíc lze v případě potřeby metodiku použít i ke kvantifikaci virové nálože ve vzorku.

Czech name

Detekce podtypů viru klíšťové encefalitidy metodou RT-qPCR

Czech description

Virus klíšťové encefalitidy (tick-borne encephalitis virus, TBEV) je řazen do rodu Flavivirus a je původcem závažných onemocnění mozku v Evropě a Asii. Genom kóduje jediný polyprotein, který je následně rozštěpen na tři strukturní proteiny - C, prM a E - a sedm nestrukturních proteinů - NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B a NS5. Na základě sekvence kódující protein E je možno dále rozdělit TBEV na tři podtypy - evropský, dálného východu a sibiřský. Jednotlivé podtypy se liší nejen lokalitou výskytu, ale hlavně průběhem onemocnění a vektorem přenášejícím daný podtyp. Zejména v evropské části Ruska a v Pobaltí se vyskytují všechny tři podtypy, proto je kladen důraz na rozlišení jednotlivých podtypů zvláště kvůli různému průběhu a závažnosti způsobeného onemocnění. Jelikož je navíc pozorován stoupající trend tohoto onemocnění, klade si metodika za cíl nejen detekci všech podtypů v jedné reakci, ale také jejich diferenciaci pomocí metody kvantitativní PCR v reálném čase. Pro zpracování metodiky byly prostudovány dostupné celogenomové sekvence viru - 27 pro evropský podtyp, 71 pro podtyp dálného východu a 23 pro sibiřský podtyp. Poté byly navrženy degenerované primery, schopné zachytit všechny tři podtypy v jedné reakci, do cílového místa kódujícího protein E. Výsledkem je produkt o délce 173 bp, jehož specificita byla ověřena jak gelovou elektroforézou, tak analýzou teplot tání produktu. Aby byla zajištěna specificita detekce pouze pro TBEV, byly analyzovány i příbuzné viry. Na základě dostupných sekvencí se podařilo navrhnout vhodné primery, které jsou schopné selektivně detekovat pouze TBEV. V následných analýzách byla ověřena specificita reakce. Výsledkem je reakce, kterou lze stanovit daný podtyp TBEV pomocí analýzy teplot tání PCR produktu. Navíc lze v případě potřeby metodiku použít i ke kvantifikaci virové nálože ve vzorku.

Type

O - Miscellaneous

CEP classification

EE - Microbiology, virology

OECD FORD branch

—

Project

<a href="/en/project/VF20112015013" target="_blank" >VF20112015013: Research of modern methods of detection and identification of hazardous CBRN substances and materials, methods of hazard reduction and decontamination; research of modern method for personal protection and elements of critical infrastructure</a><br>

Continuities

P - Projekt vyzkumu a vyvoje financovany z verejnych zdroju (s odkazem do CEP)

Publication year

2015

Confidentiality

S - Úplné a pravdivé údaje o projektu nepodléhají ochraně podle zvláštních právních předpisů