Citlivost nejvýznamnějších parodontopatogenů psa k nanočásticím stříbra

Kód výsledku v IS VaVaI

<a href="https://www.isvavai.cz/riv?ss=detail&h=RIV%2F62157124%3A16170%2F23%3A43881075" target="_blank" >RIV/62157124:16170/23:43881075 - isvavai.cz</a>

Výsledek na webu

<a href="https://www.vfu.cz/files/upload/693/Sbornik_IGA_2023.pdf" target="_blank" >https://www.vfu.cz/files/upload/693/Sbornik_IGA_2023.pdf</a>

DOI - Digital Object Identifier

—

Jazyk výsledku

čeština

Název v původním jazyce

Citlivost nejvýznamnějších parodontopatogenů psa k nanočásticím stříbra

Popis výsledku v původním jazyce

Onemocnění parodontu je nejčastěji diagnostikovaným onemocněním v klinické praxi psů a koček. Jelikož se zprvu neprojevuje závažnými klinickými příznaky, k jeho řešení často dochází až v pokročilých stavech. Parodontitida může vyústit v oronasální fistuly, endodontické onemocnění, patologické fraktury čelisti, onemocnění očí nebo osteomyelitidu. Parodontální onemocnění ale ovlivňuje i jiné orgánové systémy. Negativně ovlivňuje například funkci ledvin, jater, srdce nebo plic (Niemec, 2008). Parodontální onemocnění je výsledkem interakcí bakterií zubního plaku a imunitního systému pacienta. Bakterie se zachycují a množí v zubním plaku, následně produkují toxiny, které poškozují závěsný aparát zubu. U lidí je hlavním parodontopatogenem bakterie Porphyromonas gingivalis. U psů a koček bývá vykultivována P. gulae (Fournier, 2001) a další druhy. Imunitní systém hostitele reaguje na přítomnost bakterií vysláním neutrofilů, které bakterie pohlcují a rozkládají. Při tom dochází k uvolňování bakteriálních toxinů a destruktivních enzymů, které nadále přispívají k destrukci parodontu (Reiter and Harvey, 2010).V posledních letech vznikly studie, které zkoumaly složení bakterií v zubním plaku u psů s parodontitidou metodou PCR. Nejčastěji byly prokázány následující bakterie: Porphyromonas gingivalis (88-100 %), Prevotella nigrescens (57 %), Porphyromonas gulae (39 %). Výsledky studií se značně liší v případě bakterie Tannerella forsythia (4 % vs. 100 %). Jedna ze studií také zmiňuje výskyt bakterií rodu Treponema spp. (64 %), jednalo se o bakterie Treponema denticola (28,5 %) a Treponema putidum (42,9 %). Soubor těchto bakterií je tedy nyní dáván do souvislosti s parodontitidou psa. Nicméně některé z těchto druhů lze kultivovat také ze psů, kteří nemají klinické příznaky parodontálního onemocnění (Kačírová et al, 2022; Özavci, 2019). Terapií parodontálního onemocnění je profesionální čištění zubů (odstranění supragingiválního i subgingválního zubního plaku, leštění zubní skloviny) provedené v celkové anestezii veterinárním lékařem. Na to však musí navazovat denní domácí péče ze strany majitele. Jako nejefektivnější se ukázalo denní čištění zubů vhodným zubním kartáčkem, jehož důsledkem je při pravidelném a řádném provedení redukce zubního plaku. Jedná se tak o prevenci progrese parodontálního onemocnění.Naše zkušenost z klinické praxe je taková, že majitelé nejsou v preventivním čištění zubů důslední. Pravidelné odstranění zubního plaku nahradit nelze, nicméně rádi bychom samotné čištění doplnili další metodou, která by snahu majitelů podpořila. Nanočástice stříbra mají obecně antiseptický účinek. Jejich roztoky by tedy měly mít inhibiční případně i baktericidní účinek na bakterie kolonizující dutinu ústní psa, včetně těch, které považujeme za parodontopatogeny.(i) Studie výskytu bakterií, které jsou považovány za parodontopatogeny.U obou skupin (psi trpící parodontitidou a psi bez klinických příznaků parodontitidy) byly odebírány vzorky zubního plaku sterilními papírovým čepy a tampony a byly přeneseny do 0,5 ml redukovaného pufru ve zkumavce typu Eppendorf. V pufru byly vzorky po dobu 1 minuty homogenizovány intenzivním třením tamponu o stěnu zkumavky a do 30 minut byly přeneseny ke kultivačnímu vyšetření, které probíhalo v anaerobním boxu. Jeden díl vzorku byl v anaerobním boxu přenesen do sterilní redukované plastové zkumavky a následně zamražen a uchováván při -80 °C pro zjištění druhového zastoupení bakterií metagonomickým vyšetřením. Druhý díl vzorku byl zpracován kultivačně s využitím selektivních anaerobních agarů vhodných k izolaci bakterií z rodu Porphyromonas a Prevotella. Získané izoláty byly subkultivovány, identifikovány hmotnostní spektrometrií MALDI TOF (Bruker, Německo) a uchovány v anaerobním kryoprotektivním médiu při -80 °C pro další analýzy. Z uchovaných vzorků byla pomocí NucleoSpin®Tissue Kit (Roche) izolovaná DNA. Tato byla následně použita jako templát pro RT PCR. Pro každý vzorek bylo připraveno 5 PCR – jedna pro každý druh bakterie. RT PCR následně proběhla v LightCycler® 480 (Roche).(ii) Stanovení citlivosti izolátů vůči nanočásticím stříbra in vitroVybrané izoláty bakterií z rodu Porphyromonas a Prevotella jsou testovány mikrodiluční metodou na citlivost vůči nanočásticím stříbra. Ke stanovení citlivosti jsou využity metodiky mikrodilučního stanovení MIC a MBC (VET01, CLSI, 2020). Výchozí roztok nano stříbra (5000 p.p.m.) ve Wilkins-Chalgrenově bujónu (Oxoid, VB) v redukovaných mikrotitračních destičkách a zaočkován multiinokulátorem na denzitu 1 x 105 KTJ příslušného bakteriálního kmene včetně typového kmene Porphyromonas gingivalis. Hodnoty MIC budou odečteny jako nejnižší koncentrace potlačující množení testované kultury.(iii) Stanovení citlivosti ke koloidnímu roztoku nanočástic stříbra in vivoMajitelé psů, u kterých byl takto vzorek odebrán, aplikovali po adekvátním parodontálním ošetření komerční mukoadhezivní gel podle instrukcí příbalového letáku. Kontrolní stěr dásní a zubů za účelem ověření přítomnosti sledovaných parodontopatogenů metodou RT PCR byl proveden po 4 týdnech.Celkem bylo prozatím otestováno 25 psů obou pohlaví, různého věku a patřícím k různým plemenům (20 s parodontitidou, 5 bez klinických příznaků. Testy některých odebraných vzorků pro dlouhodobou kultivaci zatím ještě probíhají a nemohly být vyhodnoceny.Majitelé psů ze skupiny s onemocněním parodontu, kteří souhlasili s účástí na tomto projektu, aplikovali po adekvátním parodontálním ošetření psa komerční mukoadhezivní gel podle instrukcí příbalového letáku. Kontrolní stěr dásní a zubů za účelem kultivačního průkazu parodontopatogenů byl proveden po 4 týdnech, pokud se dostavili na přislíbenou kontrolu.Hodnocení výsledků stanovení citlivosti izolátů vůči nanočásticím stříbra in vitro nebylo doposud ukončeno. Komerčně vyráběné mukoadhezivní gely obsahují 0,02 % nanočástic stříbra.Kultivačně se podařilo u psů s parodontálním onemocněním prozatím prokázat přítomnost Porphyromonas gulae, Porphyromonas macacae, Prevotella nigrificans a Veilonella parvula. U části psů s parodontálním onemocněním kultivace námi hledané bakterie neodhalila. Kvantifikace při kultivaci naznačuje, že se zvyšujícím se stupněm parodontitidy, se také zvyšuje počet bakterií daného druhu. U kontrolní skupiny byla provedena kontrola metodou RT PCR.Metodou RT PCR jsme ve vzorcích vyšetřovali přítomnost bakterií Tanerella forsythia, Treponema denticola, Prevotella nigriscens a bakerie rodu Porphyromonas. Výskyt bakterie Tanerella forsythia byl prozatím potvrzen u 18 pacientů (14 psů s parodontálním onemocněním, 4 psi z kontrolní skupiny). Po aplikaci gelu bylo vyšetření prozatím zopakováno u 4 pacientů. U všech se tato bakterie v dutině ústní nadále vyskytovala. Přítomnost bakterie Treponema denticola byla metodou RT PCR zjištěna prozatím u 8 testovaných psů (7 psů s parodontálním onemocněním, 1 pes z kontrolní skupiny) z nichž kontrolní odběr doposud absolvoval jeden pes – s negativním výsledkem. Prevotella nigriscens byla detekována u 6 psů (5 psů s parodontálním onemocněním, 1 pes z kontrolní skupiny). Na kontrolní odběr se z těchto psů prozatím dostavil 1–s negativním výsledkem. Bakterie z rodu Porphyromonas byly metodou PCR detekovány u 6 psů (5 psů s parodontálním onemocněním, 1 pes z kontrolní skupiny). Vyšetření kontrolních stěrů pozitivních psů prozatím nemáme k dispozici.U všech psů, kteří trpí parodontálním onemocněním se nám kultivačně, nebo pomocí PCR podařilo potvrdit přítomnost bakterií, které dle aktuální literatury mohou parodontitidu způsobovat. Se zvyšujícím se stupněm parodontitidy pozorujeme ve výsledcích zvyšující se počet kolonií stanovovaných bakterií (kultivace). U psů trpících parodontitidou pozorujeme častěji kombinace více sledovaných bakterií. Pokud se tyto bakterie objevili v kontrolní skupině, jednalo se většinou o nález pouze jednoho sledovaného druhu. V případě jednoho psa z kontrolní skupiny se vyskytovaly dva různé druhy bakterií. Nanočástice stříbra se v dekolonizaci těchto bakterií z dutin ústní psů jeví slibně, nicméně potřebujeme více času pro odběr kontrolních vzorků (náročnost kultivace) a nasbírání více pacientů do studie. Pouze bakterie Tanerella forsythia se po aplikaci stále vyskytovala ve všech kontrolních vzorcích a použití nanočástic stříbra na její odstranění z dutiny ústní nejspíš nemá vliv.

Název v anglickém jazyce

Sensitivity of the most important periodontal pathogens of dogs to silver nanoparticles

Popis výsledku anglicky

Periodontal disease is the most commonly diagnosed disease in clinical practice in dogs and cats. As it does not initially present with severe clinical symptoms, its management often occurs only in advanced conditions. Parodontitis can result in oronasal fistulas, endodontic disease, pathological jaw fractures, eye disease or osteomyelitis. Parodontal disease also affects other organ systems. For example, it adversely affects the function of the kidneys, liver, heart or lungs (Niemec, 2008). Parodontal disease is the result of the interaction of plaque bacteria and the patient&apos;s immune system. The bacteria become trapped and multiply in the dental plaque, subsequently producing toxins that damage the hanging apparatus of the tooth. In humans, the main periodontopathogen is the bacterium Porphyromonas gingivalis. In dogs and cats, P. gulae (Fournier, 2001) and other species are commonly cultured. The host immune system responds to the presence of the bacteria by sending neutrophils to engulf and degrade the bacteria. This results in the release of bacterial toxins and destructive enzymes that continue to contribute to periodontal destruction (Reiter and Harvey, 2010).In recent years, studies have been conducted to investigate the bacterial composition of dental plaque in dogs with periodontitis by PCR. The most frequently detected bacteria were Porphyromonas gingivalis (88-100%), Prevotella nigrescens (57%), Porphyromonas gulae (39%). The results of the studies differ considerably in the case of Tannerella forsythia (4% vs. 100%). One of the studies also mentions the occurrence of bacteria of the genus Treponema spp. (64%), these were Treponema denticola (28.5%) and Treponema putidum (42.9%). Thus, a set of these bacteria is now being linked to periodontitis in the dog. However, some of these species can also be cultured from dogs that do not have clinical signs of periodontal disease (Kacirova et al, 2022; Özavci, 2019). The therapy for periodontal disease is professional teeth cleaning (removal of supragingival and subgingival plaque, polishing of tooth enamel) performed under general anaesthesia by a veterinarian. However, this must be followed by daily home care by the owner. Daily brushing with a suitable toothbrush has been found to be the most effective, resulting in plaque reduction when performed regularly and properly. It is thus a prevention of the progression of periodontal disease. Our experience in clinical practice is that owners are not consistent in preventive tooth brushing. There is no substitute for regular plaque removal, however, we would like to supplement the cleaning itself with another method to support the owners&apos; efforts. Silver nanoparticles generally have an antiseptic effect. Their solutions should therefore have an inhibitory or even bactericidal effect on bacteria colonizing the dog&apos;s oral cavity, including those we consider to be periodontopathogens.(i) Studies on the prevalence of bacteria considered to be periodontopathogens.In both groups (dogs with periodontitis and dogs without clinical signs of periodontitis), plaque samples were collected with sterile paper plugs and swabs and transferred to 0.5 ml of reduced buffer in an Eppendorf-type tube. In the buffer, the samples were homogenized for 1 min by vigorously rubbing the swab against the tube wall and within 30 min were transferred for culture examination, which was performed in an anaerobic box. One part of the sample was transferred in the anaerobic box to a sterile reduced plastic tube and subsequently frozen and stored at -80 °C for determination of bacterial species abundance by metagonomic examination. The second part of the sample was processed by culture using selective anaerobic agars suitable for the isolation of bacteria of the genera Porphyromonas and Prevotella. The obtained isolates were subcultured, identified by MALDI TOF mass spectrometry (Bruker, Germany) and preserved in anaerobic cryoprotective medium at -80 °C for further analyses. DNA was isolated from the preserved samples using the NucleoSpin®Tissue Kit (Roche). This was subsequently used as template for RT PCR. 5 PCRs were prepared for each sample - one for each bacterial species. RT PCR was then performed in a LightCycler® 480 (Roche).(ii) Determination of sensitivity of isolates to silver nanoparticles in vitroSelected isolates of bacteria from the genera Porphyromonas and Prevotella are tested by the microdilution method for sensitivity to silver nanoparticles. Microdilution methodologies for MIC and MBC (VET01, CLSI, 2020) are used to determine the sensitivity. A stock solution of silver nanoparticles (5000 p.p.m.) in Wilkins-Chalgren broth (Oxoid, UK) in reduced microtiter plates and inoculated with a multiinoculator to a density of 1 x 105 KTJ of the appropriate bacterial strain including the type strain of Porphyromonas gingivalis. The MIC values will be read as the lowest proliferation suppressing concentration of the culture tested.(iii) Determination of sensitivity to colloidal silver nanoparticle solution in vivoOwners of dogs sampled in this manner applied a commercial mucoadhesive gel after adequate periodontal treatment according to the package insert instructions. A control swab of the gums and teeth to verify the presence of the observed periodontopathogens by RT PCR was performed after 4 weeks. ResultsSo far, a total of 25 dogs of both sexes, of different ages and belonging to different breeds (20 with periodontitis, 5 without clinical signs. Testing of some of the samples collected for long-term culture is still ongoing and could not be evaluated.Owners of dogs from the group with periodontal disease who agreed to participate in this project applied commercial mucoadhesive gel after adequate periodontal treatment of the dog, according to the instructions in the package insert. Follow-up scrapings of the gums and teeth for culture demonstration of periodontopathogens were performed after 4 weeks if they attended for the promised follow-up.Evaluation of the results of the in vitro sensitivity of the isolates to silver nanoparticles has not yet been completed. Commercially produced mucoadhesive gels contain 0.02% silver nanoparticles.Cultures have so far demonstrated the presence of Porphyromonas gulae, Porphyromonas macacae, Prevotella nigrificans and Veilonella parvula in dogs with periodontal disease. In some dogs with periodontal disease, culture did not reveal the bacteria we were looking for. Quantification on culture suggests that as the degree of periodontitis increases, the number of bacteria of a given species also increases. The control group was checked by RT PCR. The presence of Tanerella forsythia, Treponema denticola, Prevotella nigriscens and Porphyromonas bacteria was investigated by RT PCR. The presence of Tanerella forsythia was confirmed in 18 patients (14 dogs with periodontal disease, 4 dogs from the control group). After gel application, the examination was repeated in 4 patients. In all of them the bacterium was still present in the oral cavity. The presence of Treponema denticola was detected by RT PCR in 8 dogs tested so far (7 dogs with periodontal disease, 1 dog from the control group), of which 1 dog has so far passed the control sampling - with a negative result. Prevotella nigriscens was detected in 6 dogs (5 dogs with periodontal disease, 1 dog from the control group). Of these dogs, 1 has so far attended the control collection with a negative result. Porphyromonas bacteria were detected by PCR in 6 dogs (5 dogs with periodontal disease, 1 dog from the control group). We do not yet have control swabs from positive dogs. ConclusionIn all dogs suffering from periodontal disease, we were able to confirm the presence of bacteria, which according to the current literature can cause periodontitis, by culture or PCR. As the degree of periodontitis increases, we observe an increase in the number of colonies of the bacteria determined in the results (culture). In dogs suffering from periodontitis, we more often observe combinations of several bacteria observed. If these bacteria were found in the control group, it was usually the finding of only one of the observed species. In the case of one dog in the control group, two different species of bacteria were present. Silver nanoparticles appear promising in decolonizing these bacteria from the oral cavities of dogs, however, more time is needed to collect control samples (difficulty of culturing) and to recruit more patients to the study. Only Tanerella forsythia was still present in all control samples after treatment and the use of silver nanoparticles probably had no effect on its removal from the oral cavity.

Druh

D - Stať ve sborníku

CEP obor

—

OECD FORD obor

40301 - Veterinary science

Projekt

—

Návaznosti

S - Specificky vyzkum na vysokych skolach

Rok uplatnění

2023

Kód důvěrnosti údajů

S - Úplné a pravdivé údaje o projektu nepodléhají ochraně podle zvláštních právních předpisů

Název statě ve sborníku

SBORNÍK PŘÍSPĚVKŮ z výsledků řešení projektů IGA VETUNI Brno 2023 financovaných z prostředků účelové podpory na specifický vysokoškolský výzkum MŠMT na rok 2023

ISBN

978-80-7305-946-0

ISSN

—

e-ISSN

—

Počet stran výsledku

4

Strana od-do

16-19

Název nakladatele

Veterinární univerzita Brno

Místo vydání

Brno

Místo konání akce

Brno

Datum konání akce

12. 12. 2023

Typ akce podle státní příslušnosti

CST - Celostátní akce

Kód UT WoS článku

—