Optimalizace procesu amplifikace DNA segmentů pomocí polymerázové řetězcové reakce
Cíle projektu
Polymerázová řetězcová reakce (PCR) je široce využívanou metodou pro amplifikaci vybraných úseků DNA. S cílem zjednodušit fázi přípravy PCR a zvýšit její citlivost a specificitu, budeme studovat úlohu aditiv na stabilitu roztoků, obsahujících pracovní pufr, nukleotidy a DNA polymerázu v optimálních koncentracích (tzv. Master mixy). Aditiva budou zahrnovat inertní barviva, inhibitory proteáz, glycerol a další komponenty zvyšující hustotu PCR reakční směsi a tetramethylammonium oxalát, který zvyšuje specificitu a výtěžnost PCR (Kovářová and Dráber, Nucleic Acid Research, 28: e70-74, 2000). Bude rovněž studován vliv těchto aditiv na tzv. LA ("long and accurate") PCR. Dále budou srovnány 2 metody používané pro zvýšení specificity PCR, tzv. "hot-start". Získané výsledky budou představovat teoretickou basi pro racionální přístupy pro jednoduché a spolehlivé metody amplifikace DNA v PCR a RNA v RT-PCR.
Klíčová slova
DNARNApolymerase chain reactionPCRRT-PCRDNA polymeraseamplificationhot start
Veřejná podpora
Poskytovatel
Akademie věd České republiky
Program
Program podpory cíleného výzkumu a vývoje
Veřejná soutěž
Program podpory cíleného výzkumu a vývoje 2 (SAV02002-S)
Hlavní účastníci
Ústav molekulární genetiky AV ČR, v. v. i.
Druh soutěže
VS - Veřejná soutěž
Číslo smlouvy
—
Alternativní jazyk
Název projektu anglicky
Optimization of DNA segments amplification by polymerase chain reaction
Anotace anglicky
The polymerase chain reaction (PCR) is a versatile method for rapid amplification of selected DNA segments. To further simplify PCR set up and to increase PCR sensitivity and specificity we will study the role of additives for stability of premixed PCR solutions containing PCR buffer, nucleotides, and DNA polymerase at optimal concentrations (Master mixes). The additives will include inert stains, protease inhibitors, glycerol and/or other compounds to increase density of Master mixes, and tetramethylammonium oxalate which we recently described as new specificity and yield enhancer of PCR (Kovářová and Dráber, Nucleic Acid Research, 28: e70-74, 2000). We will also analyze the role of these additives on LA (long and accurate) PCR. Furthermore, two different so called PCR hot start methods will be compared. The combined data should provide a theoretical background for rational approaches for simple and reliable amplification of DNA and RNA in PCR and RT-PCR, respectively.
Vědní obory
Kategorie VaV
NV - Neprůmyslový výzkum (aplikovaný výzkum s výjimkou průmyslového)
CEP - hlavní obor
EB - Genetika a molekulární biologie
CEP - vedlejší obor
EI - Biotechnologie a bionika
CEP - další vedlejší obor
CE - Biochemie
OECD FORD - odpovídající obory
(dle převodníku)10603 - Genetics and heredity (medical genetics to be 3)
10604 - Reproductive biology (medical aspects to be 3)
10605 - Developmental biology
10608 - Biochemistry and molecular biology
10609 - Biochemical research methods
20801 - Environmental biotechnology
20802 - Bioremediation, diagnostic biotechnologies (DNA chips and biosensing devices) in environmental management
20803 - Environmental biotechnology related ethics
20901 - Industrial biotechnology
20902 - Bioprocessing technologies (industrial processes relying on biological agents to drive the process) biocatalysis, fermentation
20903 - Bioproducts (products that are manufactured using biological material as feedstock) biomaterials, bioplastics, biofuels, bioderived bulk and fine chemicals, bio-derived novel materials
30101 - Human genetics
30401 - Health-related biotechnology
30402 - Technologies involving the manipulation of cells, tissues, organs or the whole organism (assisted reproduction)
30403 - Technologies involving identifying the functioning of DNA, proteins and enzymes and how they influence the onset of disease and maintenance of well-being (gene-based diagnostics and therapeutic interventions [pharmacogenomics, gene-based therapeutics])
30404 - Biomaterials (as related to medical implants, devices, sensors)
30405 - Medical biotechnology related ethics
40401 - Agricultural biotechnology and food biotechnology
40402 - GM technology (crops and livestock), livestock cloning, marker assisted selection, diagnostics (DNA chips and biosensing devices for the early/accurate detection of diseases) biomass feedstock production technologies, biopharming
40403 - Agricultural biotechnology related ethics
Hodnocení dokončeného projektu
Hodnocení poskytovatelem
U - Uspěl podle zadání (s publikovanými či patentovanými výsledky atd.)
Zhodnocení výsledků projektu
Byla nalezena nová aditiva pro amplifikace DNA v barevných reakčních směsích pro PCR. Byly připraveny nové monoklonální protilátky specifické pro Taq DNA polymerázu. Jedna z těchto protilátek byla využita v novém komerčně dostupném výrobku.
Termíny řešení
Zahájení řešení
1. 1. 2002
Ukončení řešení
1. 1. 2005
Poslední stav řešení
U - Ukončený projekt
Poslední uvolnění podpory
—
Dodání dat do CEP
Důvěrnost údajů
S - Úplné a pravdivé údaje o projektu nepodléhají ochraně podle zvláštních právních předpisů
Systémové označení dodávky dat
CEP06-AV0-IB-U/01:1
Datum dodání záznamu
19. 6. 2006
Finance
Celkové uznané náklady
2 028 tis. Kč
Výše podpory ze státního rozpočtu
1 960 tis. Kč
Ostatní veřejné zdroje financování
68 tis. Kč
Neveřejné tuz. a zahr. zdroje finan.
0 tis. Kč
Základní informace
Uznané náklady
2 028 tis. Kč
Statní podpora
1 960 tis. Kč
96%
Poskytovatel
Akademie věd České republiky
CEP
EB - Genetika a molekulární biologie
Doba řešení
01. 01. 2002 - 01. 01. 2005