Ověření kvantifikačních standardů využívaných při real-time PCR pomocí droplet digital PCR

Kód výsledku v IS VaVaI

<a href="https://www.isvavai.cz/riv?ss=detail&h=RIV%2F00027162%3A_____%2F18%3AN0000129" target="_blank" >RIV/00027162:_____/18:N0000129 - isvavai.cz</a>

Výsledek na webu

<a href="http://www.med.muni.cz/tomdny/Sbornik-TD-2018-RV2.pdf" target="_blank" >http://www.med.muni.cz/tomdny/Sbornik-TD-2018-RV2.pdf</a>

DOI - Digital Object Identifier

—

Jazyk výsledku

čeština

Název v původním jazyce

Ověření kvantifikačních standardů využívaných při real-time PCR pomocí droplet digital PCR

Popis výsledku v původním jazyce

XXVII. Tomáškovy dny mladých mikrobiologů. V současné době je kvantitativní real-time PCR (qPCR) jedna z nejpoužívanějších molekulárně-biologických metod pro detekci mikrobiálních patogenů. Nevýhodou této metody je však nezbytnost sestrojení kalibrační křivky ze standardů, jež musí být přesně kvantifikovány. V tomto ohledu zatím neexistuje metoda pro nezávislé ověřování kvantifikačních standardů. Nejčastěji se k tomuto účelu využívá spektrofotometrie, avšak spektrofotometrické měření absorbance nukleové kyseliny je ovlivněno její čistotou, což může vést k nesprávnému naředění standardu. Slibným nástrojem pro přesnou kvantifikaci těchto standardů se jeví nedávno vyvinutá metoda droplet digital PCR (ddPCR), která poskytuje absolutní kvantifikaci cílové sekvence nukleové kyseliny bez nutnosti využití kalibrační křivky. Principem metody ddPCR je naředění vzorku a rozdělení reakční směsi do emulze o přibližně 20 000 kapének, které obsahují jednu, více než jednu nebo žádnou kopii cílové nukleové kyseliny. Po amplifikaci jsou kapénky obsahující jednu nebo více kopií molekul na základě fluorescence označeny za pozitivní, zatímco kapénky s žádnou molekulou za negativní. Absolutní počet kopií cílové nukleové kyseliny přítomné ve vzorku je následně vypočítán z množství pozitivních kapének s využitím Poissonovy statistiky. Pomocí ddPCR jsme provedli ověření na čtyřech vybraných kvantifikačních standardech využívaných v našich laboratořích. Předběžné výsledky ukazují, že spektrofotometrické měření absorbance nukleové kyseliny nadhodnocuje o 30–50%. Dále byla porovnána cirkulární a linearizovaná forma těchto standardů. Z výsledků vyplývá, že linearizovaná forma plazmidu je pro standard vhodnější než cirkulární, jelikož je lépe přístupná amplifikaci cílové sekvence nukleové kyseliny. Jako poslední krok budou testovány různé kity na izolaci plazmidové DNA pro zjištění vlivu případné kontaminace.

Název v anglickém jazyce

Verification of quantification standards used in real-time PCR using droplet digital PCR

Popis výsledku anglicky

XXVII. Tomasek Days of young microbiologists. Currently, quantitative real-time PCR (qPCR) is one of the most widely used molecular biological methods for the detection of microbial pathogens. However, the disadvantage of this method is the need to construct a calibration curve from the standards that have to be precisely quantified. Spectrophotometry is used most often for this purpose, but the spectrophotometric measurement of the nucleic acid absorbance is affected by its purity, which may lead to incorrect dilution of the standard. A promising tool for accurate quantification of these standards is the recently developed droplet digital PCR (ddPCR) method, which provides absolute quantification without the need for a calibration curve. The principle of the ddPCR method is a dilution of the sample and distribution of the reaction mixture into an emulsion of approximately 20 000 droplets containing one, more than one or no copy of the target nucleic acid. Following amplification, based on fluorescence droplets containing at least one copy of the molecule are marked as positive, while droplets with no molecule are marked as negative. The absolute number of copies of the target nucleic acid present in the sample is then calculated from the number of positive droplets using Poisson´s statistics. Using ddPCR, we have verified four selected quantification standards used in our laboratories. Preliminary results show that the spectrophotometric measurement of the absorbance of the nucleic acid overestimates by 30-50%. Furthermore, the circular and linearized form of these standards were compared. The results show that the linearized form of the plasmid is more suitable for the standard than the circular, since amplification of the target nucleic acid sequence is better accessible As a last step, various isolation kits will be tested for the isolation of plasmid DNA to determine the effect of potential contamination.

Druh

O - Ostatní výsledky

CEP obor

—

OECD FORD obor

10608 - Biochemistry and molecular biology

Projekt

<a href="/cs/project/QK1810212" target="_blank" >QK1810212: Rychlé, komplexní a multiplexní metody pro simultánní detekci původců alimentárních onemocnění v potravinách živočišného a rostlinného původu</a><br>

Návaznosti

P - Projekt vyzkumu a vyvoje financovany z verejnych zdroju (s odkazem do CEP)<br>I - Institucionalni podpora na dlouhodoby koncepcni rozvoj vyzkumne organizace

Rok uplatnění

2018

Kód důvěrnosti údajů

S - Úplné a pravdivé údaje o projektu nepodléhají ochraně podle zvláštních právních předpisů