Kvantifikace qPCR standardů s využitím digitální PCR

Kód výsledku v IS VaVaI

<a href="https://www.isvavai.cz/riv?ss=detail&h=RIV%2F00027162%3A_____%2F19%3AN0000029" target="_blank" >RIV/00027162:_____/19:N0000029 - isvavai.cz</a>

Výsledek na webu

<a href="http://www.rank.cz/files/sbornik-RANK-2019.pdf" target="_blank" >http://www.rank.cz/files/sbornik-RANK-2019.pdf</a>

DOI - Digital Object Identifier

—

Jazyk výsledku

čeština

Název v původním jazyce

Kvantifikace qPCR standardů s využitím digitální PCR

Popis výsledku v původním jazyce

15. ročník konference RANK 2019, 6. a 7. února 2019 v prostorách hotelu Zlatá Štika v Pardubicích - poster. Kvantitativní real-time PCR (qPCR) je v současné době jedna z nejčastěji využívaných molekulárně biologických metod pro detekci a kvantifikaci různých mikrobiálních patogenů. Pro kvantifikaci je nezbytné sestrojení kalibrační křivky ze standardů obsahujících známé množství kopií plazmidů, genomové DNA nebo jiných molekul nukleových kyselin. Přesné stanovení množství kopií nukleové kyseliny ve standardu je proto zásadní pro správnou kvantifikaci patogenů ve vzorku. Nejčastěji se pro tyto účely využívá spektrofotometrické měření absorbance nukleové kyseliny, nicméně nedostatečná čistota může ovlivnit výsledky měření a následné naředění qPCR standardů. Digitální PCR (dPCR), jež umožňuje absolutní kvantifikaci cílové sekvence nukleové kyseliny, není na rozdíl od qPCR závislá na sestrojení kalibrační křivky, proto se jeví slibným nástrojem pro nezávislé ověřování qPCR standardů. Principem dPCR je rozdělení výchozího vzorku do několika tisíců reakčních oddílů, ve kterých probíhá odděleně amplifikace nukleové kyseliny. Reakčními oddíly mohou být emulzní kapénky (dropletová dPCR) nebo jamky umístěné na malém digitálním mikročipu (čipová dPCR). Po amplifikaci jsou spočítány pozitivní a negativní reakční oddíly na základě přítomnosti či nepřítomnosti fluorescenčního signálu. Pozitivní reakční oddíly, které obsahovaly alespoň jednu cílovou molekulu nukleové kyseliny, jsou následně využity pro výpočet koncentrace s použitím Poissonovy statistiky. Cílem práce bylo stanovit a porovnat koncentrace 48 qPCR standardů pomocí dPCR a zjistit vliv použití různých izolačních kitů na přípravu qPCR standardů.

Název v anglickém jazyce

Quantification of qPCR standards using digital PCR

Popis výsledku anglicky

15th RANK 2019 Conference, 6th and 7th February 2019 at the Hotel Zlatá Štika in Pardubice – poster. Quantitative real-time PCR (qPCR) is currently one of the most commonly used molecular biological methods for the detection and quantification of various microbial pathogens. In order to quantify the amount of microbial pathogens, it is necessary to construct a calibration curve from standards containing known amounts of copies of plasmids, genomic DNA or other nucleic acid molecules. Accurate determination of the amount of nucleic acid copies in the standard is therefore essential for proper quantification of pathogens in the sample. Spectrophotometric measurement of absorbance of nucleic acid is the most commonly used for this purposes, however, insufficient purity can affect the results of measurement and subsequent dilution of qPCR standards. Digital PCR (dPCR), which allows absolute quantification of the target nucleic acid sequence, is not, unlike qPCR, dependent on the construction of a calibration curve, therefore it is a promising tool for independent verification of qPCR standards. The principle of dPCR is the division of the initial sample to several thousands of reaction compartments in which nucleic acid amplification takes place separately. The reaction compartments may be emulsion droplets (droplet dPCR) or wells placed on a small digital microchip (chip dPCR). After amplification, positive and negative reaction compartments are counted based on the presence or absence of a fluorescence signal. Positive reaction compartments containing at least one target nucleic acid molecule are then used to calculate the concentration of the target nucleic acid in the sample using Poisson's statistics. The aim of the work was to determine and compare the concentration of 48 qPCR standards using dPCR and to determine the effect of using several isolation kits on the preparation of qPCR standards.

Druh

O - Ostatní výsledky

CEP obor

—

OECD FORD obor

10608 - Biochemistry and molecular biology

Projekt

<a href="/cs/project/QK1810212" target="_blank" >QK1810212: Rychlé, komplexní a multiplexní metody pro simultánní detekci původců alimentárních onemocnění v potravinách živočišného a rostlinného původu</a><br>

Návaznosti

P - Projekt vyzkumu a vyvoje financovany z verejnych zdroju (s odkazem do CEP)<br>I - Institucionalni podpora na dlouhodoby koncepcni rozvoj vyzkumne organizace

Rok uplatnění

2019

Kód důvěrnosti údajů

S - Úplné a pravdivé údaje o projektu nepodléhají ochraně podle zvláštních právních předpisů