Detekce podtypů viru klíšťové encefalitidy metodou RT-qPCR

Kód výsledku v IS VaVaI

<a href="https://www.isvavai.cz/riv?ss=detail&h=RIV%2F70565813%3A_____%2F15%3A%230000519" target="_blank" >RIV/70565813:_____/15:#0000519 - isvavai.cz</a>

Výsledek na webu

—

DOI - Digital Object Identifier

—

Jazyk výsledku

čeština

Název v původním jazyce

Detekce podtypů viru klíšťové encefalitidy metodou RT-qPCR

Popis výsledku v původním jazyce

Virus klíšťové encefalitidy (tick-borne encephalitis virus, TBEV) je řazen do rodu Flavivirus a je původcem závažných onemocnění mozku v Evropě a Asii. Genom kóduje jediný polyprotein, který je následně rozštěpen na tři strukturní proteiny - C, prM a E - a sedm nestrukturních proteinů - NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B a NS5. Na základě sekvence kódující protein E je možno dále rozdělit TBEV na tři podtypy - evropský, dálného východu a sibiřský. Jednotlivé podtypy se liší nejen lokalitou výskytu, ale hlavně průběhem onemocnění a vektorem přenášejícím daný podtyp. Zejména v evropské části Ruska a v Pobaltí se vyskytují všechny tři podtypy, proto je kladen důraz na rozlišení jednotlivých podtypů zvláště kvůli různému průběhu a závažnosti způsobeného onemocnění. Jelikož je navíc pozorován stoupající trend tohoto onemocnění, klade si metodika za cíl nejen detekci všech podtypů v jedné reakci, ale také jejich diferenciaci pomocí metody kvantitativní PCR v reálném čase. Pro zpracování metodiky byly prostudovány dostupné celogenomové sekvence viru - 27 pro evropský podtyp, 71 pro podtyp dálného východu a 23 pro sibiřský podtyp. Poté byly navrženy degenerované primery, schopné zachytit všechny tři podtypy v jedné reakci, do cílového místa kódujícího protein E. Výsledkem je produkt o délce 173 bp, jehož specificita byla ověřena jak gelovou elektroforézou, tak analýzou teplot tání produktu. Aby byla zajištěna specificita detekce pouze pro TBEV, byly analyzovány i příbuzné viry. Na základě dostupných sekvencí se podařilo navrhnout vhodné primery, které jsou schopné selektivně detekovat pouze TBEV. V následných analýzách byla ověřena specificita reakce. Výsledkem je reakce, kterou lze stanovit daný podtyp TBEV pomocí analýzy teplot tání PCR produktu. Navíc lze v případě potřeby metodiku použít i ke kvantifikaci virové nálože ve vzorku.

Název v anglickém jazyce

Detection of tick-borne encephalitis virus subtypes by RT-qPCR

Popis výsledku anglicky

Tick-borne encephalitis virus (TBEV) belongs to the Flavivirus genus and it is the cause of serious encephalitic disease in Europe and Asia. The genome encodes the only polyprotein which is subsequently cleaved into three structural proteins – C, prM and E – and seven non-structural proteins - NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B a NS5. According to the E protein coding sequence TBEV can be further divided into three subtypes – European, Far Eastern and Siberian. Particular subtypes differ not only in their location, but mainly by the course of the disease and by their vectors. All three subtypes co-circulate mainly in the European regions of Russia and in Baltic States, so that emphasis is put on differentiation of particular subtypes, because of different seriousness as well as course of the illness. Moreover, it has been documented upward trend of incidence of tick-borne encephalitis and therefore the aim of this methodology is not only the detection of subtypes in single reaction, but also their differentiation by real-time quantitative PCR. For the purpose of this methodology, accessible whole-genome sequences of TBEV were examined – 27 of European subtype, 71 of Far Eastern subtype and 23 of Siberian subtype. Afterwards, a degenerated primer pair was designed in E protein coding sequence in order to detect all three subtypes in single reaction. The resulted 173 bp long product was verified by gel electrophoresis and melting analysis. To ensure the specificity of detection, related virus species were analysed. On the basis of available sequence data suitable primers selectively detecting TBEV were designed. In subsequent analyses the specificity of reaction was verified. The resulted reaction enables to determine TBEV subtype by melting analysis of PCR amplicon. In addition, viral load in the sample can be also specified.

Druh

O - Ostatní výsledky

CEP obor

EE - Mikrobiologie, virologie

OECD FORD obor

—

Projekt

<a href="/cs/project/VF20112015013" target="_blank" >VF20112015013: Výzkum moderních metod detekce a identifikace nebezpečných CBRN látek a materiálů, metod snížení jejich nebezpečnosti a dekontaminace; výzkum moderních prostředků ochrany osob a prvků kritické infrastruktury</a><br>

Návaznosti

P - Projekt vyzkumu a vyvoje financovany z verejnych zdroju (s odkazem do CEP)

Rok uplatnění

2015

Kód důvěrnosti údajů

S - Úplné a pravdivé údaje o projektu nepodléhají ochraně podle zvláštních právních předpisů