Multiplexní detekce DNA skotu, prasete, ovce, kozy a kura v potravinách a krmivech metodou MOL-PCR (Multiplex oligonucleotide ligation-polymerase chain reaction)

Kód výsledku v IS VaVaI

<a href="https://www.isvavai.cz/riv?ss=detail&h=RIV%2F00027162%3A_____%2F18%3AN0000198" target="_blank" >RIV/00027162:_____/18:N0000198 - isvavai.cz</a>

Výsledek na webu

<a href="https://www.vri.cz/userfiles/file/Certifikovane_metodiky/2018/VUVeL-Certifikovana_metodika-95-Piskata-Multiplex_det_DNA_skotu,prasete,ovce,kozy_a_kura_v_potr_a_krm.pdf" target="_blank" >https://www.vri.cz/userfiles/file/Certifikovane_metodiky/2018/VUVeL-Certifikovana_metodika-95-Piskata-Multiplex_det_DNA_skotu,prasete,ovce,kozy_a_kura_v_potr_a_krm.pdf</a>

DOI - Digital Object Identifier

—

Jazyk výsledku

čeština

Název v původním jazyce

Multiplexní detekce DNA skotu, prasete, ovce, kozy a kura v potravinách a krmivech metodou MOL-PCR (Multiplex oligonucleotide ligation-polymerase chain reaction)

Popis výsledku v původním jazyce

Cílem metodiky je simultánní detekce DNA skotu (Bos taurus), prasete (Sus scrofa domesticus), kura (Gallus gallus f. domestica), ovce (Ovis aries) a kozy (Capra aegagrus hircus) v potravinách a krmivech s ohledem na jejich složení, za účelem ověření autenticity druhů deklarovaných, případně průkaz druhů nedeklarovaných. Metodika je využitelná jako diagnostický nástroj pro odhalování falšování potravin a krmiv způsobeným druhovou záměnou. Metoda MOL-PCR založená na ligaci oligonukleotidů nebyla dosud pro průkaz autenticity potravin a krmiv vědecky publikována a vytváří tak nový diagnostický nástroj pro ověření druhové deklarace v potravinách a krmivech. Metodika představuje inovaci v metodologii kontroly složení potravin a krmiv, jejíž přínos spočívá především v multiplexním simultánním stanovení pěti živočišných druhů v rámci jedné analýzy s potenciálem dodatečného přidání dalších druhů s dosahem 50-100 cílů. Výhodou metody je také její schopnost detekce velmi krátkých PCR fragmentů (do 100 bp), čímž může být usnadněna druhová identifikace ve zpracovaných potravinách, kdy vlivem technologických procesů dochází často k degradaci DNA a jejímu rozpadu na kratší fragmenty. Navržené MOL-PCR systémy jsou navíc založeny na amplifikaci genomové DNA, která oproti standardně používaným cílům v mitochondriální DNA poskytuje vyšší specificitu a především bude zaručeno, že v tkáních bude vždy stejné množství kopií cílové DNA, na rozdíl od mitochondriální DNA. Metodika bude uplatněna orgány státní správy (SZPI, SVS) prostřednictvím akreditované laboratoře pro detekci falšování potravin a krmiv na Výzkumném ústavu veterinárního lékařství, v.v.i. Brno jako prostředek pro monitorování autenticity výrobků ve smyslu ověření správné druhové deklarace potravin a krmiv. Kromě orgánů státní správy může být metodika využita také soukromými subjekty a spotřebiteli pro prokazování jakosti potravin a krmiv.

Název v anglickém jazyce

Multiplex detection of DNA from beef, pig, sheep, goat and chicken in food and feed using MOL-PCR method (Multiplex oligonucleotide ligation-polymerase chain reaction)

Popis výsledku anglicky

The aim of the methodology is the simultaneous detection of DNA of cattle (Bos taurus), pig (Sus scrofa domesticus), chicken (Gallus gallus f. Domestica), sheep (Ovis aries) and goat (Capra aegagrus hircus) in order to verify the authenticity of the species declared, or to prove undeclared species. The methodology is useful as a diagnostic tool for detecting adulteration of food and feed due to species substitution. The MOL-PCR method, based on oligonucleotide ligation, has not yet been scientifically published to prove the authenticity of food and feed and thus creates a new diagnostic tool for verifying the species declaration in food and feed. The methodology introduces an innovation in the methodology for controlling the composition of food and feed, the benefit of which lies above all in the multiplex simultaneous determination of five animal species within a single analysis with the potential to add additional species with a range of 50-100 targets. The advantage of the method is also its ability to detect very short PCR fragments (up to 100 bp), thereby facilitating species identification in processed foods, where DNA degradation often result in shorter fragments due to technological processes. Moreover, the proposed MOL-PCR systems are based on amplification of genomic DNA that provides higher specificity than standard targets in mitochondrial DNA and, above all, ensures that tissues will always have the same amount of copies of target DNA as opposed to mitochondrial DNA. The methodology will be applied by the state administration bodies (SZPI, SVS) through the Accredited laboratory for the detection of food and feed adulteration at the Veterinary Research Institute, v.v.i. Brno as a means of monitoring the authenticity of products in the sense of verifying the correct species declaration of food and feed. In addition to state administration bodies, the methodology can also be used by private bodies and consumers to demonstrate the quality of food and feed.

Druh

N_metC - Metodiky certifikované oprávněným orgánem

CEP obor

—

OECD FORD obor

40401 - Agricultural biotechnology and food biotechnology

Projekt

<a href="/cs/project/QJ1530107" target="_blank" >QJ1530107: Metody pro identifikaci, sledovatelnost a ověřování autenticity potravin a krmiv s komponenty živočišného původu</a><br>

Návaznosti

P - Projekt vyzkumu a vyvoje financovany z verejnych zdroju (s odkazem do CEP)

Rok uplatnění

2018

Kód důvěrnosti údajů

S - Úplné a pravdivé údaje o projektu nepodléhají ochraně podle zvláštních právních předpisů

Interní identifikační kód produktu

CM 95/2018

Číslo předpisu

7/2018

Technické parametry

Tato metodika popisuje multiplexní oligonukleotidovou ligační polymerázovou řetězovou reakci (MOL-PCR) s interní amplifikační kontrolou (IAC), která slouží k simultánní identifikaci pěti druhů potravinářsky významných zvířat v potravinách a krmivech na základě detekce vybraných oblastí genomové DNA. Kvalitativní detekce probíhá prostřednictvím odečtení fluorescenčního signálu vzorku oproti negativní kontrole. Vyvinutý systém umožňuje dodatečné přidání dalších cílů podle aktuálních požadavků. Metodika je založená na komplexním postupu zahrnujícím izolaci DNA ze vzorku, přípravu magnetických kuliček (potahování, validace), ligaci, PCR a vlastní analýzu MOL-PCR produktů v přístroji MagPix. Metoda MOL-PCR nebyla dosud pro průkaz autenticity potravin a krmiv vědecky publikována a vytváří tak nový diagnostický nástroj pro ověření druhové deklarace v potravinách a krmivech. V kombinaci s interní kontrolou dochází k eliminaci falešně negativních výsledků způsobených přítomností inhibitorů, a s ohledem na provedené optimalizace, stanovení detekčního limitu, systému kontrol a hodnocení, tak umožňuje rychlý skríning vyšetřovaného vzorku na širokou škálu živočišných druhů. Specifita MOLig byla porovnána pomocí programu BioEdit (14 živočišných druhů pro gen mical1, 25 druhů pro gen RPS7 a 23 druhů pro gen rps16). Navržené sekvence MOLig pro všech pět živočišných druhů jsou 100% identické s referenčními sekvencemi dostupnými v databázi BLAST (whole genome shotgun) a současně nevykazují shodu se sekvencemi jinými živočišných druhů. Specifita byla navíc prakticky testována na celé řadě živočišných druhů, které mohou být využity pro potravinářské účely (skot, prase, kůň, králík, ovce, koza, kuře a další). Detekční limit MOL-PCR systému byl proveden v podobě koncentračního gradientu izolované DNA (100 – 0,01 ng pro daný cíl) a byl stanoven na 1 ng/µl (MFI > 200). Zpracování dat a interpretace výsledků: Od naměřených hodnot mediánu intenzity fluorescence (MFI) se odečte hodnota BLANKu 30 MFI (empiricky stanovená hodnota). Jednotlivé MFI hodnoty vzorků se podělí MFI hodnotou negativní kontroly NTC (no template control). Je-li výsledný poměr (P) vyšší než 4 a zároveň hodnota MFI daného vzorku vyšší než 200, vzorek je pozitivní.

Ekonomické parametry

Náklady na zavedení metodiky do běžné laboratorní praxe zahrnují náklady na pořízení spotřebního materiálu, kitu na izolaci DNA, chemikálií, magnetických koulí, sond a dalších reagencií. Kalkulace nákladů na materiál na vyšetření jednoho vzorku (duplicitně) bez izolace DNA je zhruba 155 Kč. Náklady na přístrojové vybavení (centrifuga, horký blok, vortex, 2 sady pipet, ultrasonic clean bath, magnetický separátor, termocykler, UV box) jsou předpokládaným vybavením laboratoře využívající metodiku, tudíž nejsou započítány do nákladů. Pořízení přístroje Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader představuje položku cca 700 000-800 000 Kč.

Označení certifikačního orgánu

Státní zemědělská a potravinářská inspekce, Květná 15, 603 00 Brno

Datum certifikace

—

Způsoby využití výsledku

C - Výsledek je využíván bez omezení okruhu uživatelů