Multiplexní systém TaqMan qPCR pro stanovení a kvantifikaci potenciálně patogenních mikrořas rodu Prototheca ve vzorcích mléka

Kód výsledku v IS VaVaI

<a href="https://www.isvavai.cz/riv?ss=detail&h=RIV%2F00027162%3A_____%2F21%3AN0000061" target="_blank" >RIV/00027162:_____/21:N0000061 - isvavai.cz</a>

Výsledek na webu

<a href="https://www.vri.cz/wp-content/uploads/2021/04/FV1056_Final_Bacova.pdf" target="_blank" >https://www.vri.cz/wp-content/uploads/2021/04/FV1056_Final_Bacova.pdf</a>

DOI - Digital Object Identifier

—

Jazyk výsledku

čeština

Název v původním jazyce

Multiplexní systém TaqMan qPCR pro stanovení a kvantifikaci potenciálně patogenních mikrořas rodu Prototheca ve vzorcích mléka

Popis výsledku v původním jazyce

Prototékóza u zvířat či lidí je způsobena achlorofylními řasami rodu Prototheca a patří k poměrně vzácným endemickým prozánětlivým infekcím. Zejména P. bovis (dříve Prototheca zopfii genotyp 2) je často skloňována jako nebakteriální původce mastitidy skotu. V této studii představujeme multiplexní systém real-time PCR (qPCR) pro rychlou a přesnou detekci a kvantifikaci prototék. Byl stanoven limit detekce, diagnostická citlivost a specificita. Byly vybrány specifické sekvence v genech AccD (kódující acetyl CoA reduktázu) pro P. bovis, cox1 (kódující podjednotku 1 cytochrom C oxidázy) pro P. wickerhamii, cytB (kódující cytochrom B) pro P. blashkeae a atp6 (kódující transportní ATPázu). Pro identifikaci a kvantifikaci druhů byla použita podjednotka F0 6) pro P. ciferrii (dříve Prototheca zopfii genotyp 1) spolu s genem, kódujícím sekvenci velké ribozomální podnednotky RNA, detekující rod Prototheca. Nová metodika qPCR byla aplikována na 55 jednotlivých vzorků kravského mléka ze stáda podezřelého z prototékózy, 41 objemových vzorků mléka z různých českých farem, 16 vzorků mléka v krabicích zakoupených v supermarketech a 21 vzorků životního prostředí pocházejících z farmy podezřelé z prototekózy.

Název v anglickém jazyce

Multiplex TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of pro-inflammatory microalgae Prototheca spp. in milk samples

Popis výsledku anglicky

Protothecosis in animals or humans is caused by achlorophyll algae of the genus Prototheca. It belongs to the relatively rare endemic pro-inflammatory infections. In particular, P. bovis (formerly Prototheca zopfii genotype 2) is often listed as a non-bacterial cause of bovine mastitis. In this study, we present a multiplex real-time PCR (qPCR) system for fast and accurate detection and quantification of several Prototheca species. The limit of detection, diagnostic sensitivity and specificity were determined. Specific sequences in the genes AccD (encoding acetyl CoA reductase) for P. bovis, cox1 (encoding cytochrome C oxidase subunit 1) for P. wickerhamii, cytB (encoding cytochrome B) for P. blashkeae and atp6 (encoding ATPase transport) were selected. The subunit F06) for P. ciferrii (formerly Prototheca zopfii genotype 1) was used for species identification and quantification together with a large ribosomal subunit sequence detecting the genus Prototheca. The new qPCR methodology was applied to 55 individual milk samples from a herd suspected of prototecosis, 41 bulk tank milk samples from various Czech farms, 16 milk samples in boxes purchased in supermarkets and 21 environmental samples from a farm suspected of prototecosis.

Druh

G_funk - Funkční vzorek

CEP obor

—

OECD FORD obor

40201 - Animal and dairy science; (Animal biotechnology to be 4.4)

Projekt

<a href="/cs/project/QK1910092" target="_blank" >QK1910092: Nebakteriální původci mastitid a jejich vliv na kvalitu a technologické vlastnosti mléka</a><br>

Návaznosti

P - Projekt vyzkumu a vyvoje financovany z verejnych zdroju (s odkazem do CEP)<br>I - Institucionalni podpora na dlouhodoby koncepcni rozvoj vyzkumne organizace

Rok uplatnění

2021

Kód důvěrnosti údajů

S - Úplné a pravdivé údaje o projektu nepodléhají ochraně podle zvláštních právních předpisů

Interní identifikační kód produktu

1056/2021

Číselná identifikace

ISBN 978-80-7672-007-7

Technické parametry

Pro vývoj detekčního systému byly vybrány nejčastěji se vyskytující druhy prototéky v prostředí mléčných farem: P. bovis, P. blashkeae, P. ciferrii a lidský patogen P. wickerhamii. Následně byl vypracován návrh detekčního systému, který se skládá ze dvou multiplexů. Funkční vzorek obsahuje ucelené informace o přípravě vzorků mléka, izolaci DNA, návrhu unikátních specifických primerů a fluorescenčních sond. Dále byly optimalizovány parametry qPCR, včetně složek reakční směsi. Byla provedena absolutní kvantifikace počtu kopií genů, která vycházela z klonování specifických úseků do bakteriální plazmidové DNA. Pro vzorky z farem byla spočtena diagnostická specificita a senzitivita a limit detekce.

Ekonomické parametry

Pro diagnosticky vybavenou laboratoř spočívají náklady v pořízení spotřebního materiálu, chemikálií, syntézu oligonukleotidů a zejména soupravy pro izolaci DNA a kitu pro qPCR. Vzorek je analyzován v duplikátu a náklady na materiál na vyšetření jednoho vzorku (bez DPH) se pohybují kolem 780 Kč za vzorek, a to včetně použití standardů a kontrol. Tato práce je podpořena Ministerstvem zemědělství [QK1910092] a podporou Ministerstva zemdělství [MZE-RO0518].

Kategorie aplik. výsledku dle nákladů

—

IČO vlastníka výsledku

00027162

Název vlastníka

Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i.

Stát vlastníka

CZ - Česká republika

Druh možnosti využití

A - K využití výsledku jiným subjektem je vždy nutné nabytí licence

Požadavek na licenční poplatek

A - Poskytovatel licence na výsledek požaduje licenční poplatek

Adresa www stránky s výsledkem

https://www.vri.cz/wp-content/uploads/2021/04/FV1056_Final_Bacova.pdf